Mikroskopia ekspansyjna

Mikroskopia ekspansyjna (ExM) to narzędzie do przygotowywania próbek biologicznych, które pozwala badaczom identyfikować małe struktury poprzez rozszerzanie ich za pomocą układu polimerowego . Założeniem jest wprowadzenie sieci polimerowej do próbek komórek lub tkanek, a następnie fizyczne rozszerzenie tej sieci polimerowej za pomocą reakcji chemicznych w celu zwiększenia rozmiaru struktur biologicznych. Oprócz innych korzyści, ExM umożliwia obrazowanie tych małych struktur za pomocą szerszego zakresu technik mikroskopowych. Został po raz pierwszy zaproponowany w artykule z 2015 roku przez Fei Chena, Paula W. Tillberga i Edwarda Boydena . Obecne badania pozwalają na ekspansję próbek do 16x większych niż ich początkowy rozmiar. Ta technika okazała się przydatna w różnych warunkach laboratoryjnych, takich jak analiza cząsteczek biologicznych. ExM pozwala naukowcom używać standardowego sprzętu do identyfikacji małych struktur, ale wymaga przestrzegania procedur w celu zapewnienia jednoznacznych wyników.

Zasady

Zamiar

4-etapowy proces ExM

Tradycyjna mikroskopia świetlna ma ograniczenia rozdzielczości, które uniemożliwiają jej niezawodne rozróżnienie małych struktur ważnych dla funkcji biologicznych i zamiast tego muszą być obrazowane techniką o wyższej rozdzielczości, taką jak mikroskopia elektronowa . Na przykład pęcherzyki synaptyczne mają średnicę 40-50 nanometrów, czyli poniżej powszechnie podawanej granicy rozdzielczości wynoszącej 200 nanometrów dla mikroskopii świetlnej. Mikroskopia ekspansyjna rozwiązuje ten problem, rozszerzając leżącą pod nią próbkę tkanki. Jedną z głównych zalet próbek przygotowanych przy użyciu mikroskopii ekspansyjnej i mikroskopii świetlnej w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią elektronową jest to, że umożliwia ona również badaczom barwienie i wizualizację poszczególnych cząsteczek w próbce, takich jak określone białka lub RNA , w celu określenia ich gęstości i rozmieszczenia w stosunku do biologicznego interesujące struktury. Najbardziej korzystną zasadą mikroskopii ekspansyjnej jest to, że nie wymaga ona specjalistycznego sprzętu; materiały do ​​rozbudowy są warte niewiele lub nic w porównaniu z ceną mikroskopu, który mógłby uzyskać taką samą rozdzielczość.

Gradacja

Mikroskopia ekspansyjna to proces wieloetapowy, który w zależności od protokołu ma różne wymagania dotyczące żelowania i ekspansji. Sekwencja kroków to plama, łączenie, trawienie i rozszerzanie. Proces barwienia może przybierać różne formy i wymaga jedynie, aby fluorofory mogły przyczepić się do polimeru w następnym etapie. Łączenie to proces dodawania żelu polimerowego do komórek, który przenika przez komórkę. Etap łączenia obejmuje również, jak sama nazwa wskazuje, proces łączenia fluoroforów z żelem. Etap trawienia polega na dodaniu roztworu, który trawi komórkę, usuwając strukturę z komórki. Jeśli ten krok się nie powiedzie, żel nie rozszerzy się równomiernie, ponieważ komórka będzie próbowała pozostać razem. Niepowodzenie tego kroku może również spowodować pękanie lub pęknięcia w komórce. Wreszcie ekspansja powoduje fizyczne rozszerzenie żelu we wszystkich kierunkach, co powoduje, że fluorofory przyłączone do żelu również się rozszerzają.

Historia

W 2015 roku Chen, Tillberg i Boyden, wszyscy z MIT , po raz pierwszy opisali mikroskopię ekspansyjną jako metodę zwiększania rozdzielczości mikroskopii poprzez pęcznienie próbki zamiast używania sprzętu o wyższej rozdzielczości. Od tego czasu wykorzystanie ExM stale rośnie. Nowatorstwo tej techniki oznacza, że ​​opracowano niewiele zastosowań. Najczęstszym zastosowaniem są próbki biologiczne.

W 2016 roku opublikowano kilka artykułów szczegółowo opisujących obejścia tradycyjnego ograniczenia ExM w zakresie sond do znakowania. Zmiany te zaproponowały sposób wykorzystania ExM z konwencjonalnymi sondami mikroskopowymi, umożliwiając szersze zastosowanie. W 2016 r. zastosowano te nowe metody znakowania, aby umożliwić mikroskopię fluorescencyjną cząsteczek RNA, co z kolei doprowadziło do precyzyjnego przestrzennie sekwencjonowania in situ, mianowicie ExSeq (sekwencjonowanie ekspansji), w 2021 r.

nie można rozdzielić blaszek amyloidu beta związanych z chorobą Alzheimera . Boyden opracował „mikroskopię ujawniającą ekspansję” w 2022 roku, dodając znaczniki fluorescencyjne po ekspansji zamiast przed. Zastąpił enzymy ciepłem. Umożliwiło to nawet 20-krotną ekspansję bez uszkadzania białek. Został wykorzystany do ujawnienia synaps i rzucenia światła na chorobę Alzheimera, ujawniając sporadyczne spirale białka amyloidu-beta wokół aksonów , które są nitkowatymi częściami komórek nerwowych przenoszącymi impulsy elektryczne.

Teoria

Mikroskopię ekspansyjną uzyskuje się poprzez syntezę układu polimerowego w próbce. Dzięki pęcznieniu tej sieci polimerowej próbka jest ekspandowana w celu zbadania przy użyciu konwencjonalnych narzędzi do analizy mikroskopowej bez degradacji integralności próbki. Pozwala to na analizę próbki za pomocą mikroskopu o mniejszej mocy, niż byłby potrzebny bez rozszerzenia, i sprawia, że ​​analiza mikroskopijnych próbek biologicznych jest bardziej dostępna dla laboratoriów, które w innym przypadku nie byłyby dostępne, aby pozwolić sobie na niezbędną technologię mikroskopii lub uzyskać ją.

Aplikacje

Używać

Mikroskopia ekspansyjna to metoda, która poprawia ostateczną rozdzielczość obrazu podczas zwykłej mikroskopii poprzez fizyczne powiększenie organizmu, tkanki lub samej cząsteczki. Po powiększeniu organizmu, tkanki lub cząsteczki, bardziej standardowe mikroskopy mogą uzyskać obrazowanie z wyższą rozdzielczością mniejszych właściwości fizjologicznych. Podstawowymi dziedzinami, w których stosowana jest ta metoda, są te związane z analizą próbek biologicznych z dodatkiem immunobarwienia lub barwników fluorescencyjnych. Etykiety fluorescencyjne są nakładane po mikroskopii ekspansyjnej, aby uwidocznić gęste skupiska białek i cząsteczek. Jednak od tego czasu technika ta została przyjęta w wielu różnych dziedzinach badań i nadal się rozwija i jest stosowana w coraz większej liczbie warunków laboratoryjnych.

Choroby i diagnozy

Przed odkryciem mikroskopii ekspansyjnej badania struktur komórkowych i biomolekuł wykonywano za pomocą mikroskopii z ograniczoną dyfrakcją. Stosowano je głównie do diagnozowania lub badania patogenezy wielu różnych stanów przedchorobowych i chorobowych. Jednak biomolekuły mają wymiary w nanoskali i są zlokalizowane z nanoskalową precyzją w komórkach i tkankach. Zastosowano kilka technik, takich jak mikroskopia superrozdzielcza , ale wymagały one złożonego sprzętu i były trudne do zastosowania w tkankach ludzkich. W ten sposób rozwinęła się mikroskopia ekspansyjna. Metoda ta umożliwiała fizyczne powiększenie próbek tkanek, a nie optykę, dzięki czemu możliwe było uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości. Te wysokiej jakości obrazy tkanek stały się punktem zwrotnym w rozwoju mikroskopii diagnostycznej i medycznej.

Podobnie jak wiele innych technik, mikroskopia ekspansyjna ma również wiele możliwości w dziedzinie medycyny i diagnostyki. Mikroskopia ekspansyjna poprawia rozdzielczość mikroskopii świetlnej poprzez fizyczne rozszerzanie próbek. Kiedy ta technika jest stosowana do klinicznych próbek tkanek, obrazowanie próbek tkanek ludzkich w nanoskali. Po pierwsze, patologia ekspansji jest wykorzystywana do przekształcania próbek klinicznych w stan zgodny z mikroskopią ekspansji. Proces ten może być wykorzystany do optycznej diagnostyki choroby nerek o minimalnych zmianach , wczesnych zmian nowotworowych piersi oraz do wykrywania różnic między normalnymi próbkami tkanek ludzkich a próbkami tkanek nowotworowych, umożliwiając rutynowe wykorzystanie w badaniach klinicznych. Zastosowanie patogennej mikroskopii ekspansji umożliwiło uzyskanie wyraźnych obrazów tkanki. Zastosowanie mikroskopii ekspansyjnej na mikromacierzach zawierających próbki z różnych narządów, takich jak piersi, prostata, płuca, okrężnica, trzustka, nerki, wątroba i jajniki, w tym tkanek prawidłowych i zawierających nowotwory, umożliwiło diagnostykę i badanie sieci komórkowej stanu chorobowego tkanki. To obrazowanie ujawnia cechy granicznych rozmiarów subdyfrakcji włókien pośrednich keratyny i wimentyny , krytyczne w nabłonkowym przejściu mezenchymalnym, progresji raka i inicjacji przerzutów.

W przyszłości, po dalszym rozwoju tej techniki, przewiduje się obserwację nanoskali morfologii biomolekuł i próbek z szerokiej gamy narządów ludzkich.

Neuronauka

Wiele pytań dotyczących neuronauki próbuje odpowiedzieć i zrozumieć molekuły i okablowanie w obwodach neuronowych . Jednak mapowanie tych struktur w dużych skalach obwodów neuronowych jest trudne. W takich przypadkach ExM powiększa próbki biologiczne, takie jak obwody mózgowe, i ułatwia ich mapowanie. Biomolekuły , takie jak białka i kwasy nukleinowe, są zakotwiczone w polimerze, który następnie pęcznieje w celu rozszerzenia biomolekuł. Ze względu na zwiększoną odległość między biomolekułami zwykłe mikroskopy mogą wtedy wykonywać obrazowanie w rozdzielczości nanoskali. Dzięki zastosowaniu techniki ExM neuronaukowcy mogą łatwiej mapować obrazy synaps, komórek i obwodów neuronowych.

podzbiory

Wraz z rozwojem mikroskopii ekspansyjnej naukowcy zaczęli tworzyć podzbiory tej techniki, w tym skaningową mikroskopię ekspansyjną Joule'a lub SJEM. SJEM wykorzystuje technikę obrazowania termicznego, która mierzy rozszerzalność cieplną elementów ogrzewanych Joule'em. Jedną z największych zalet SJEM w porównaniu ze starszymi submikronowymi technikami termowizyjnymi jest to, że SJEM nie wymaga nanoprodukcji specjalistycznych sond. SJEM wymaga raczej standardowego mikroskopu sił atomowych i prostej elektroniki.

Zalety

Jedną z najważniejszych zalet mikroskopii ekspansyjnej w porównaniu z innymi formami mikroskopii jest to, że nie wymaga ona mocniejszego sprzętu optycznego do wykonywania obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Ponieważ ExM powiększa próbkę fizyczną, zwalnia badaczy z konieczności zakupu drogiego sprzętu mikroskopowego, takiego jak mikroskopy elektronowe do badań w superrozdzielczości. Rozszerzając próbkę, staje się ona łatwiejsza do zbadania, ponieważ większe struktury można następnie zbadać przy użyciu tradycyjnych technik mikroskopii, takich jak mikroskopia świetlna.

Ograniczenia

Każdy z czterech etapów przygotowania ExM musi zostać w pełni zakończony, w przeciwnym razie komórka nie da jasnego i wyraźnego zabarwienia. Niewykonanie tych czynności może spowodować pęknięcie komórki lub nierównomierne rozszerzenie, zniekształcając obraz nie do użytku. ExM boryka się z tymi procedurami, które wykorzystują fluoroforowe , ponieważ proces polimeryzacji może wybielić te fluorofory, czyniąc je bezużytecznymi. Niektóre, takie jak Alexa 488 i Atto 565, są nadal skuteczne po polimeryzacji, jednak ich skuteczność jest znacznie zmniejszona do około 50%. Koniugacja DNA z innym przeciwciałem jest często bardzo kosztowna i trudna. Te dwie kwestie są głównymi ograniczeniami stosowania ExM w próbkach biologicznych. Należy zauważyć, że chociaż ponowne wiązanie nowych przeciwciał może być kosztowne i czasochłonne, czasami jest to możliwe po ekspansji, w przypadkach, gdy przeciwciało ma trudności z wiązaniem się w gęstej tkance. Po ekspansji tkanka jest znacznie mniej gęsta i często pozwala na lepszy odbiór przeciwciał fluorescencyjnych.