NAD+ Five-prime cap
W biologii molekularnej NAD+ pięciorzędowa czapka (NAD+ 5' cap) odnosi się do cząsteczki dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego ( NAD+ ), metabolitu zawierającego nukleozyd, kowalencyjnie związanego z końcem 5' komórkowego mRNA . Podczas gdy częściej spotykana z metylowanej guanozyny ( m7G ) jest dodawana do RNA przez kompleks czapeczek, który wiąże się z polimerazą RNA II ( RNAP II ), czapeczka NAD jest dodawana podczas inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA sam, działając jako niekanoniczny nukleotyd inicjujący (NCIN). W związku z tym, chociaż czapeczka m7G może wystąpić tylko w organizmach posiadających wyspecjalizowane kompleksy czapeczki, ponieważ czapeczka NAD jest wykonywana przez RNAP , przypuszcza się, że występuje w większości, jeśli nie we wszystkich organizmach.
Czapka NAD+ 5' została zaobserwowana u bakterii , w przeciwieństwie do długo utrzymywanego przekonania, że prokarioty nie miały RNA z czapeczką 5' , jak również na czapce 5' eukariotycznego mRNA zamiast czapeczki m7G. Ta modyfikacja potencjalnie pozwala również na selektywną degradację RNA w prokariotach , ponieważ różne szlaki są zaangażowane w degradację RNA 5′-trifosforanu z czapeczką NAD + i bez czapeczki.
W komórkach eukariotycznych , podczas gdy częściej obserwowana czapka m7G promuje stabilność mRNA i wspiera translację , czapka NAD+ celuje w transkrypt RNA w celu rozpadu, co jest ułatwione przez niekanoniczny enzym dekapujący, DXO. Biorąc pod uwagę centralne miejsce NAD w chemii redoks i potranslacyjnej modyfikacji białek , jego przyłączenie do RNA reprezentuje potencjalnie nieodkryte szlaki w metabolizmie i regulacji RNA.
Funkcja u prokariotów
U prokariotów modyfikacja 5' NAD+ jest ustalana przez bakteryjny RNAP podczas inicjacji transkrypcji i wykazano, że wykazuje funkcje analogiczne do funkcji czapeczki eukariotycznej 5'. Wykazano, że transkrybowany in vitro RNA modyfikowany NAD jest bardziej odporny na RNazę E , główny enzym w szlaku rozpadu E. coli . Ponadto wykazano, że modyfikacja NAD spowalnia przetwarzanie RNA przez pirofosfohydrolazę RNA (RppH), o której wiadomo, że wyzwala rozpad, w którym pośredniczy RNaza-E, poprzez konwersję 5′-trifosforanu-RNA do 5′-monofosforanu-RNA. Nudc, fosfohydrolaza nudix , może dekapować NAD-RNA poprzez hydrolizę NAD(H) do NMN(H) i AMP, powodując rozpad za pośrednictwem RNazy-E, ale jest nieaktywny wobec 5′-trifosforanu-RNA. Ta modyfikacja 5 'pozwala na selektywną inicjację degradacji podzbioru RNA, ponieważ RNA z czapeczkami NAD są stabilizowane w obecności RppH, ale są zdejmowane przez Nudc, podczas gdy RNA 5'-trifosforanowe są podatne na RppH, ale nie Nudc.
Sekwencjonowanie nowej generacji ( NGS ) koniugatów NAD-RNA w E. coli ujawniło obfitość określonej grupy małych regulatorowych RNA (sRNA), o których wiadomo, że są zaangażowane w systemy odpowiedzi na stres, a także enzymy biorące udział w metabolizmie komórkowym . Niewielka liczba transkryptów RNA z czapeczką NAD może umożliwić komórce selektywną degradację tych RNA niezależnie od innych szlaków. Biorąc pod uwagę, że wiadomo, że reakcje na stres wpływają na NAD + stężenie, odkrycie to dodatkowo potwierdza możliwość nieodkrytych szlaków łączących stan energetyczny komórki z obrotem mRNA.
Sugerowano również, że czapeczki NAD rekrutują określone białka na końcu 5' RNA, ponieważ NAD jest jednym z najpowszechniejszych ligandów białkowych . Kieszenie wiążące NAD są dobrze scharakteryzowane w wielu białkach i mogą pomóc w lokalizacji RNA do enzymu lub receptora . Wiele enzymów metabolicznych wykorzystujących NAD może również wiązać się z RNA , co stwarza możliwość powstania nieznanych kompleksów rybonukleoproteinowych .
Funkcja u eukariontów
RNA z czapeczką NAD+ 5' stwierdzono u drożdży , ludzi i Arabidopsis thaliana . U eukariontów czapeczka NAD+ jest usuwana przez niekanoniczne enzymy dekapujące z rodziny DXO. DeNADing przez DXO daje monofosforanowy RNA na końcu 5' inny niż NudC, co daje NMN plus 5' monofosforanowy RNA. Co ważne, DXO jest ~ 6-krotnie bardziej skuteczny w usuwaniu czapeczki NAD+ w porównaniu z m7G , co sugeruje, że selektywnie degraduje RNA z czapeczką NAD zamiast bardziej powszechnej czapeczki m7G, podobnie jak NudC.
Wykazano, że czapka m7G promuje translację poprzez rekrutację kompleksu inicjującego na mRNA . Jednak czapeczka NAD+ nie zapewnia podobnej funkcji, jak mRNA z czapeczką NAD+ i poliadenylowany wykazywał podobne poziomy translacji in vitro do mRNA bez czapeczki . Dodatkowo, czapka 5 'NAD + dodatkowo sprzyja rozpadowi RNA, do którego jest przyłączona, wykazano in vitro , że mRNA z czapeczką NAD + i poliadenylowany jest mniej stabilny niż mRNA pozbawione czapeczki 5' , co sugeruje, że modyfikacja NAD + aktywnie ułatwia rozpad RNA za pośrednictwem DXO.
Podczas gdy ustalono związek między białkami wiążącymi RNA, takimi jak dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa ( GAPDH ), a stężeniem NAD+, postawiono hipotezę, że czapeczka NAD+ reprezentuje bezpośredni związek między poziomami ekspresji RNA a metabolizmem komórkowym. Wiadomo, że stresy energetyczne, takie jak glukozy i ograniczenie kaloryczne, wpływają na stężenia NAD+ i mogą prawdopodobnie wpływać na ograniczenie NAD+. Dodatkowo, ponieważ warunki o niskiej zawartości składników odżywczych mogą wpływać na mRNA , a czapeczki NAD + promują mRNA rozpadu, możliwe jest, że stan energetyczny komórki może wpływać na tworzenie czapeczek NAD+, a tym samym na obrót mRNA . Pewne odkrycia, takie jak większa obfitość transkryptów z czapeczkami NAD+ w bakteriach w fazie stacjonarnej, jak również w drożdżach hodowanych na pożywkach syntetycznych, wskazują na taką możliwość.