Obrazowanie fluorescencyjne z przełączaniem ultradźwięków

Obrazowanie fluorescencji przełączanej ultradźwiękami (USF) jest techniką obrazowania z wykorzystaniem głębokiej optyki. W ciągu ostatnich kilku dekad mikroskopia fluorescencyjna została bardzo rozwinięta do obrazowania próbek biologicznych i żywych tkanek. Jednak ze względu na rozpraszanie światła mikroskopia fluorescencyjna jest ograniczona do tkanek płytkich (około 1 mm). Ponieważ fluorescencja charakteryzuje się wysokim kontrastem, wysoką czułością i niskim kosztem, co ma kluczowe znaczenie dla badania informacji o tkankach głębokich, obiecujące byłoby opracowanie techniki obrazowania fluorescencyjnego z wysokim stosunkiem głębokości do rozdzielczości. Ostatnio opracowano obrazowanie fluorescencyjne z przełączaniem ultradźwięków osiągnąć wysokie stosunek sygnału do szumu (SNR) i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przestrzennej bez poświęcania głębi obrazu.

Podstawowa zasada

Model teoretyczny został po raz pierwszy zaproponowany przez Yuana w 2009 roku. Opracował modulowaną ultradźwiękami fluorescencję opartą na systemie mikropęcherzyków znakowanych fluoroforem-wygaszaczem, który może kontrolować emisję fluorescencji wewnątrz strefy ogniskowej ultradźwięków w celu zwiększenia rozdzielczości przestrzennej i SNR obrazowania . Jeśli chodzi o zasadę obrazowania USF, stosuje się krótki impuls ultradźwiękowy, aby aktywować emisję fluorescencyjną wewnątrz ogniska ultradźwiękowego bez wyzwalania fluorescencji poza ogniskową ultradźwiękową. W ten sposób rozmieszczenie fluoroforów w strefie ogniskowej ultradźwięków można rozróżnić i zobrazować poprzez przeszukiwanie celu. W technice obrazowania USF wymagane są dwa podstawowe elementy, pierwszy to unikalne środki kontrastowe USF, których emisję fluorescencji można kontrolować za pomocą zogniskowanej fali ultradźwiękowej. Po drugie, do wykrywania sygnału i tłumienia szumów tła wymagany jest również czuły system obrazowania USF.

Obrazowe środki kontrastowe

Obecnie opracowano dwa rodzaje środków kontrastowych.

• Mikropęcherzyki znakowane fluoroforem

Pierwszym typem są mikropęcherzyki znakowane fluoroforem-wygaszaczem, które zostały po raz pierwszy odkryte przez Yuana w 2019 roku i opracowane przez Liu i in. w 2014 r. Podstawową zasadą działania tego typu środka kontrastowego jest zmiana stężenia fluoroforu na powierzchni mikropęcherzyków. W 2000 roku Morgan i in. odkryli, że ujemna fala ultradźwiękowa może kilkakrotnie powiększyć mikropęcherzyk. W rezultacie zwiększa się odległość między wygaszaczem a fluoroforem na powierzchni mikropęcherzyków (stężenie fluoroforu na powierzchni zmniejsza się), co oznacza, że ​​skuteczność wygaszania jest bardzo zmniejszona, a fluorofor wykazuje wysoką wydajność emisyjną (stan ON). Mikropęcherzyki poza strefą ogniskowania ultradźwięków zachowują ten sam mały rozmiar przez cały proces, więc skuteczność wygaszania jest zawsze wystarczająco wysoka, aby stłumić emisję fluoroforu (stan OFF).

• Termoczułe polimery znakowane fluoroforem lub nanocząstki otoczone fluoroforem (NP)

Drugi rodzaj środków kontrastowych to termoczułe polimery znakowane fluoroforem lub nanocząstki otoczone fluoroforem (NP). Krytyczną częścią tego rodzaju środka jest połączenie termoczułego nośnika i znakowanego na nim wrażliwego na środowisko (zwykle wrażliwego na polaryzację) fluoroforu. Gdy temperatura otoczenia jest poniżej pewnego progu (T _th1 ), polaryzacja nośnika, na którym znajduje się fluorofor wykazuje dość niską skuteczność emisyjną (stan OFF). Po zastosowaniu zogniskowanych ultradźwięków strefa ogniskowa jest podgrzewana powyżej progu temperatury (T _th2 ) i zmieni się struktura termoczułego nośnika, co spowoduje zmianę jego biegunowości, w związku z czym polaryzacyjnoczuły fluorofor zostanie nakryty. Podczas całego procesu fluorofor poza strefą ogniskowania ultradźwięków pozostaje wyłączony, ponieważ temperatura jest niższa od _Tth1 .

System obrazowania USF

Celem systemu obrazowania USF jest czułe wykrywanie sygnału USF i radykalne tłumienie szumów tła. System obrazu najpierw radykalnie zwiększa czułość systemu, stosując wzmacniacz typu lock-in i chłodzoną lampę fotopowielacza (PMT); Następnie system wykorzystuje algorytm korelacji do odróżnienia sygnału USF od szumu tła; Ponadto wykrywa tylko zmianę sygnału fluorescencji spowodowaną przez ultradźwięki. Laser wzbudzający o modulowanej częstotliwości działa cały czas, wywołany ultradźwiękami wzrost temperatury zmienia amplitudę sygnału fluorescencji w modulowanej częstotliwości. Po zakłóceniu sygnału odniesienia z blokadą fazową, wzmacniacz blokujący zgłasza sygnał USF; System może również zmniejszyć wyciek lasera za pomocą kilku filtrów emisyjnych.

Stosunek sygnału do szumu

Obrazowanie USF może zwiększyć SNR poprzez odróżnienie fotonów sygnałowych od fotonów tła. Fotony tła mogą pochodzić z autofluorescencji, rozpraszania światła, niedoskonałych środków kontrastowych i wycieku lasera. Aby zmniejszyć autofluorescencję, można zastosować fluorofor NIR , ponieważ składniki tkanki biologicznej wytwarzają najmniej autofluorescencji w regionie NIR. Zgodnie z teorią Rayleigha:

ja(r,θ) = 1/λ ⁴

Światło o dużej długości fali rozprasza się mniej, więc rozpraszanie światła, które powoduje część szumu tła, może zostać zmniejszone. Ponadto, stosując ultradźwięki do kontrolowania emisji fluorescencyjnej, fluorofor sygnałowy można łatwo odróżnić od fluoroforu tła. Jak wspomnieliśmy powyżej, wyciek lasera można zminimalizować za pomocą filtrów emisyjnych.

Rozkład przestrzenny

W przypadku stosowania drugiego rodzaju środków kontrastowych (nanocząsteczek termoczułych znakowanych fluoroforem) rozdzielczość przestrzenną można dodatkowo poprawić w oparciu o dwa mechanizmy.

• Nieliniowy efekt akustyczny

Dyfrakcja akustyczna jest główną przeszkodą w zwiększeniu rozdzielczości przestrzennej. Kontrolując moc ekspozycji ultradźwięków, może wystąpić nieliniowy efekt akustyczny, w wyniku którego część energii akustycznej o częstotliwości podstawowej może zostać przeniesiona na składowe wyższych częstotliwości harmonicznych w objętości ogniskowej, które mogą być bardziej skupione. Jest to główny powód, dla którego nieliniowy efekt akustyczny może zmniejszyć ogniskową temperatury wywołaną ultradźwiękami.

• Uwięzienie termiczne

Rozdzielczość przestrzenna techniki USF jest określona przez rozmiar obszaru, w którym fluorofory mogą zostać włączone. Tylko temperatura jest powyżej progu, fluorofor może zostać włączony. Jednak ze względu na dyfuzję termiczną lub przewodnictwo cieplne energia cieplna indukowana ultradźwiękami musi być ograniczona do rozmiaru ogniska poprzez kontrolowanie czasu ekspozycji na ultradźwięki, więc fluorofory mogą być włączane i są zwykle mniejsze niż rzeczywisty rozmiar ogniska ultradźwięków.

Aplikacje

Technikę USF można łączyć z techniką opóźnienia impulsu świetlnego i techniką zliczania fotonów, aby uzyskać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w głębokim mętnym ośrodku. W 2016 roku Cheng i in. uzyskali obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości w fantomach tkankowych o głębokości centymetra z wysokim SNR i wysoką czułością, zsyntetyzowali i scharakteryzowali niezwykle wrażliwy na środowisko fluorofor NIR, ADP(CA)2, oraz rodzinę środków kontrastowych USF opartych na tym barwniku. W niedawnym badaniu z 2019 r. Yao i in. po raz pierwszy uzyskany in vivo Obrazowanie fluorescencji z przełączaniem ultradźwięków u myszy o wysokiej rozdzielczości. Nanocząstki PNIPAM zamknięte w ICG zostały przyjęte jako środki kontrastowe, które są dość stabilne w środowisku biologicznym. W porównaniu z wynikami obrazowania CT stwierdzili, że obrazowanie USF utrzymuje wysoką czułość i swoistość w głębokich tkankach.