Odzyskiwanie antygenu

Tkanki zakonserwowane formaldehydem , wysoce reaktywnym związkiem, zawierają różne modyfikacje chemiczne, które mogą zmniejszać wykrywalność białek w procedurach biomedycznych, takich jak immunohistochemia . Odzyskiwanie antygenu to podejście do zmniejszania lub eliminowania tych modyfikacji chemicznych. Dwie podstawowe metody antygenu to odzyskiwanie epitopów za pośrednictwem ciepła (HIER) i odzyskiwanie epitopów indukowane proteolitycznie (PIER).

Odzyskiwanie epitopów indukowane proteazą (PIER)

W PIER enzymy, w tym proteinaza K, trypsyna i pepsyna, zostały użyte do przywrócenia wiązania przeciwciała z jego epitopem. Rzekomy mechanizm działania polega na rozszczepianiu peptydów maskujących epitop, przywracając antygenowość.

Wady PIER obejmują niski wskaźnik powodzenia w przywracaniu immunoreaktywności oraz potencjalne zniszczenie morfologii tkanki i antygenu będącego przedmiotem zainteresowania.

Wywołane ciepłem odzyskiwanie epitopów (HIER)

Uważa się, że HIER odwraca niektóre wiązania poprzeczne i umożliwia przywrócenie drugorzędowej lub trzeciorzędowej struktury epitopu. Protokół wymaga optymalizacji dla każdej badanej tkanki, metody utrwalania i antygenu.

Ogólnie rzecz biorąc, HIER ma znacznie wyższy wskaźnik sukcesu niż PIER. HIER można wykonywać za pomocą kuchenek mikrofalowych, szybkowarów, parowarów warzywnych, autoklawów lub kąpieli wodnych. HIER jest wrażliwy na czas, temperaturę, bufor i pH.

Odzyskiwanie epitopów w temperaturze pokojowej (RTER)

RTER polega na odwróceniu wiązań poprzecznych za pomocą kwasów, takich jak kwas solny (pH 1) lub kwas mrówkowy (pH 2).

Odzyskiwanie epitopów z zamrożonych skrawków (FSER)

FSER odnosi się do dwóch metod odzyskiwania antygenu zaprojektowanych specjalnie dla skrawków tkankowych lub hodowanych komórek utrwalonych aldehydem w kriostacie; metody SDS i Heating En Bloc.

Metoda SDS wymaga krótkiej, 5-minutowej obróbki wstępnej przy użyciu 1% SDS i może spowodować zwiększenie intensywności barwienia metodą IHC, jak również immunofluorescencji.

Heating En Bloc pobiera bloki tkanek utrwalone w paraformaldehydzie, podgrzewa je w roztworach do odzyskiwania, a następnie zamraża za pomocą suchego lodu. Ogrzewanie jest już stosowane w AR i okazało się, że jest szeroko skuteczne, ale wykazano, że poprzednie metody ogrzewania zabijają zamrożone sekcje. Ta metoda okazała się zwiększać immunoreaktywność dla szerokiego zakresu antygenów iw niektórych przypadkach obniżać barwienie tła.