PCR in silico

In silico PCR odnosi się do narzędzi obliczeniowych używanych do obliczania teoretycznych wyników reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu danego zestawu starterów ( sond ) do amplifikacji sekwencji DNA z sekwencjonowanego genomu lub transkryptomu .

Narzędzia te służą do optymalizacji projektowania starterów dla docelowych sekwencji DNA lub cDNA . Optymalizacja starterów ma dwa cele: wydajność i selektywność. Wydajność obejmuje uwzględnienie takich czynników, jak zawartość GC, wydajność wiązania, komplementarność, struktura drugorzędowa oraz temperatura wyżarzania i topnienia (Tm) . Selektywność starterów wymaga, aby pary starterów przypadkowo nie wiązały się z przypadkowymi miejscami innymi niż cel będący przedmiotem zainteresowania, ani też pary starterów nie wiązały się z konserwatywnymi regionami rodziny genów. Jeśli selektywność jest słaba, zestaw starterów amplifikuje wiele produktów oprócz celu będącego przedmiotem zainteresowania.

Przykładowy wynik PCR in silico z oprogramowaniem jPCR.

Zaprojektowanie odpowiednich par krótkich lub długich starterów to tylko jeden z celów przewidywania produktu PCR. Inne informacje dostarczane przez in silico mogą obejmować określanie lokalizacji starterów, orientacji, długości każdego amplikonu , symulację ruchliwości elektroforetycznej , identyfikację otwartych ramek odczytu oraz łącza do innych zasobów internetowych.

Dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania oferujących różne proporcje zestawu funkcji, łatwości użytkowania, wydajności i kosztów. Primer-BLAST jest szeroko stosowany i dostępny bezpłatnie na stronie internetowej National Center for Biotechnology Information (NCBI). Z drugiej strony, aplikacja komercyjna FastPCR umożliwia jednoczesne testowanie pojedynczego startera lub zestawu starterów zaprojektowanych dla multipleksowych sekwencji docelowych. Wykonuje szybkie dopasowanie bez przerw, aby przetestować komplementarność starterów z sekwencjami docelowymi. Prawdopodobne produkty PCR można znaleźć dla liniowych i kołowych matryc przy użyciu standardowego lub odwrotnego PCR jak również do multipleksowego PCR . VPCR przeprowadza dynamiczną symulację multipleksowego PCR, pozwalając na oszacowanie ilościowych efektów współzawodnictwa między wieloma amplikonami w jednej reakcji. Przeglądarka genomu UCSC oferuje funkcję isPCR , która zapewnia wyjście graficzne oraz plik tekstowy do przeglądania produktów PCR na ponad 100 zsekwencjonowanych genomach.

Starter może wiązać się z wieloma przewidywanymi sekwencjami, ale tylko sekwencje bez lub z kilkoma niedopasowaniami (1 lub 2, w zależności od lokalizacji i nukleotydu) na końcu 3' startera mogą być stosowane do wydłużania polimerazy. Ostatnie 10-12 zasad na końcu 3' startera jest wrażliwych na inicjację wydłużania polimerazy i ogólną stabilność startera w miejscu wiązania matrycy. Efekt pojedynczego niedopasowania w tych ostatnich 10 zasadach na końcu 3' startera zależy od jego położenia i lokalnej struktury, zmniejszając wiązanie startera, selektywność i wydajność PCR.

Linki zewnętrzne