Optymalizacja reakcji łańcuchowej polimerazy
Reakcja łańcuchowa polimerazy ( PCR) jest powszechnie stosowanym narzędziem biologii molekularnej do amplifikacji DNA oraz różnymi technikami optymalizacji PCR , które zostały opracowane przez biologów molekularnych w celu poprawy wydajności PCR i zminimalizowania niepowodzeń.
Kontaminacja i PCR
Metoda PCR jest niezwykle czuła i wymaga tylko kilku cząsteczek DNA w jednej reakcji do amplifikacji w kilku rzędach wielkości. Dlatego należy podjąć odpowiednie środki, aby uniknąć zanieczyszczenia jakimkolwiek DNA obecnym w środowisku laboratoryjnym ( bakterie , wirusy) . lub źródeł ludzkich). Ponieważ produkty z poprzednich amplifikacji PCR są częstym źródłem zanieczyszczeń, wiele laboratoriów biologii molekularnej wdrożyło procedury, które obejmują podzielenie laboratorium na oddzielne obszary. Jeden obszar laboratorium jest przeznaczony do przygotowywania i obsługi odczynników przed PCR oraz konfiguracji reakcji PCR, a drugi do przetwarzania po PCR, takiego jak elektroforeza żelowa lub oczyszczanie produktu PCR. W celu przygotowania reakcji PCR wiele standardowych procedur operacyjnych obejmuje użycie pipet z końcówkami z filtrem i noszenie świeżych rękawic laboratoryjnych , aw niektórych przypadkach komorę z przepływem laminarnym z lampą UV jako stanowiskiem roboczym (w celu zniszczenia wszelkich formacji extraneomultimeru). PCR rutynowo ocenia się w porównaniu z kontrolą ujemną , którą przeprowadza się identycznie jak w przypadku eksperymentalnego PCR, ale bez matrycy DNA i przeprowadza się ją równolegle z eksperymentalnym PCR.
Spinki do włosów
Struktury drugorzędowe w DNA mogą powodować fałdowanie lub wiązanie matrycy DNA lub starterów, co prowadzi do zmniejszenia wydajności produktu lub niepowodzenia reakcji. Spinki do włosów , które składają się z wewnętrznych fałd spowodowanych parowaniem zasad między nukleotydami w odwróconych powtórzeniach w obrębie jednoniciowego DNA, są powszechnymi strukturami drugorzędowymi i mogą skutkować niepowodzeniem PCR.
Zazwyczaj projekt startera, który obejmuje sprawdzenie potencjalnych struktur drugorzędowych w starterach lub dodanie DMSO lub glicerolu do PCR w celu zminimalizowania struktur drugorzędowych w matrycy DNA, jest stosowany w optymalizacji PCR, które mają historię niepowodzeń z powodu podejrzenia Spinki do włosów z DNA.
Błędy polimerazy
Polimeraza Taq nie ma aktywności egzonukleazy 3' do 5' . Tak więc, Taq nie ma działania zabezpieczającego przed błędami odczytu , które polega na wycięciu każdej nowo źle włączonej zasady nukleotydowej z powstającej (tj. wydłużającej się) nici DNA, która nie pasuje do swojej przeciwnej zasady w komplementarnej nici DNA. Brak korekty 3′ do 5′ enzymu Taq skutkuje wysokim odsetkiem błędów (mutacje na nukleotyd na cykl) około 1 na 10 000 zasad, co wpływa na wierność PCR, zwłaszcza jeśli błędy występują na wczesnym etapie PCR z małe ilości materiału wyjściowego, powodując akumulację dużej części zamplifikowanego DNA o nieprawidłowej sekwencji w produkcie końcowym.
Dostępnych stało się kilka polimeraz DNA o „wysokiej wierności”, mających zmodyfikowaną aktywność egzonukleazy 3 ′ do 5 ′, co pozwala na dokładniejszą amplifikację do zastosowania w PCR do sekwencjonowania lub klonowania produktów. Przykłady polimeraz o aktywności egzonukleazy 3' do 5' obejmują: polimerazę DNA KOD, rekombinowaną postać Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, który jest ekstrahowany z Thermococcus litoralis ; polimeraza DNA Pfu , która jest ekstrahowana z Pyrococcus furiosus ; Pwo, który jest ekstrahowany z Pyrococcus woesii ; Polimeraza Q5, z 280-krotnie wyższą wiernością amplifikacji w porównaniu z Taq .
Stężenie magnezu
Magnez jest wymagany jako kofaktor termostabilnej polimerazy DNA. Polimeraza Taq jest enzymem zależnym od magnezu i określenie optymalnego stężenia ma kluczowe znaczenie dla powodzenia reakcji PCR. Niektóre składniki mieszaniny reakcyjnej, takie jak stężenie matrycy, dNTP oraz obecność czynników chelatujących ( EDTA ) lub białek , mogą zmniejszać ilość obecnego wolnego magnezu, zmniejszając w ten sposób aktywność enzymu. Startery, które wiążą się z niewłaściwymi miejscami matrycy, są stabilizowane w obecności nadmiernych stężeń magnezu, co skutkuje zmniejszeniem specyficzności reakcji. Nadmierne stężenia magnezu stabilizują również dwuniciowy DNA i zapobiegają całkowitej denaturacji DNA podczas PCR, zmniejszając wydajność produktu. Nieodpowiednie rozmrożenie MgCl 2 może powodować powstawanie gradientów stężeń w roztworze chlorku magnezu dostarczanego z polimerazą DNA, a także przyczynia się do wielu nieudanych eksperymentów.
Rozmiar i inne ograniczenia
PCR łatwo działa z matrycą DNA o długości do dwóch do trzech tysięcy par zasad. Jednak powyżej tej wielkości wydajność produktu często spada, ponieważ wraz ze wzrostem długości stochastyczne , takie jak przedwczesna terminacja przez polimerazę, zaczynają wpływać na wydajność PCR. Możliwe jest amplifikowanie większych kawałków do 50 000 par zasad przy wolniejszym cyklu ogrzewania i specjalnych polimerazach. Są to polimerazy połączone z białkiem wiążącym DNA wzmacniającym procesowość, wzmacniającym przyleganie polimerazy do DNA.
Inne cenne właściwości chimerycznych polimeraz TopoTaq i PfuC2 obejmują zwiększoną termostabilność, specyficzność i odporność na zanieczyszczenia i inhibitory . Zostały one zaprojektowane przy użyciu unikalnych domen wiążących DNA helisy-szpilki-helisy (HhH) topoizomerazy V z hipertermofilnego Methanopyrus kandleri . Chimeryczne polimerazy pokonują wiele ograniczeń natywnych enzymów i są stosowane w bezpośredniej amplifikacji PCR z hodowli komórkowych, a nawet próbek żywności , omijając w ten sposób pracochłonne etapy izolacji DNA. Silna aktywność przemieszczania nici hybrydowej polimerazy TopoTaq pomaga rozwiązać problemy PCR, które mogą być spowodowane przez spinki do włosów i podwójne helisy obciążone G. Helisy o wysokiej zawartości GC mają wyższą temperaturę topnienia, co często utrudnia PCR, w zależności od warunków.
Niespecyficzne torowanie
Niespecyficzne wiązanie starterów występuje często i może wystąpić z kilku powodów. Należą do nich sekwencje powtórzeń w matrycy DNA, niespecyficzne wiązanie między starterem a matrycą, wysoka lub niska zawartość GC w matrycy lub niekompletne wiązanie startera, pozostawiając koniec 5' startera niezwiązany z matrycą. Powszechne jest również niespecyficzne wiązanie zdegenerowanych starterów . Manipulacja temperaturą wyżarzania i magnezem stężenie jonów można wykorzystać do zwiększenia specyficzności. Na przykład niższe stężenia magnezu lub innych kationów mogą zapobiegać niespecyficznym interakcjom ze starterami, umożliwiając w ten sposób udaną reakcję PCR. Enzym polimerazy typu „hot-start”, którego aktywność jest zablokowana, chyba że zostanie podgrzany do wysokiej temperatury (np. 90–98˚C) podczas etapu denaturacji pierwszego cyklu, jest powszechnie stosowany w celu zapobiegania niespecyficznemu pobudzaniu podczas przygotowywania reakcji w temp. niższe temperatury. Chemiczne reakcje PCR typu hot-start wymagają wyższych temperatur i dłuższych czasów inkubacji do aktywacji polimerazy w porównaniu z reakcjami PCR typu hot-start opartymi na przeciwciałach lub aptamerach. [ potrzebny cytat ]
Inne metody zwiększające swoistość obejmują Nested PCR i Touchdown PCR .
Symulacje komputerowe teoretycznych wyników PCR ( elektroniczny PCR ) mogą być przeprowadzone w celu pomocy w projektowaniu starterów.
Reakcja łańcuchowa polimerazy touchdown lub reakcja łańcuchowa polimerazy typu touchdown to metoda reakcji łańcuchowej polimerazy, dzięki której startery unikają amplifikacji niespecyficznych sekwencji. Temperatura przyłączania podczas reakcji łańcuchowej polimerazy determinuje specyficzność przyłączania starterów. Temperatura topnienia podkładu wyznacza górną granicę temperatury wyżarzania. W temperaturach tuż poniżej tego punktu wystąpią tylko bardzo specyficzne parowania zasad między starterem a matrycą. W niższych temperaturach startery wiążą się mniej specyficznie. Niespecyficzne wiązanie starterów przesłania wyniki reakcji łańcuchowej polimerazy, ponieważ niespecyficzne sekwencje, do których przyłączają się startery we wczesnych etapach amplifikacji, „wypierają” wszelkie specyficzne sekwencje ze względu na wykładniczy charakter amplifikacji polimerazy.
Najwcześniejsze etapy cyklu reakcji łańcuchowej polimerazy z przyziemieniem mają wysokie temperatury wyżarzania. Temperaturę wygrzewania obniża się skokowo dla każdego kolejnego zestawu cykli (liczbę poszczególnych cykli i przyrostów obniżenia temperatury wybiera prowadzący). Starter będzie hybrydyzował w najwyższej temperaturze, która w najmniejszym stopniu pozwala na niespecyficzne wiązanie, jakie jest w stanie tolerować. Tak więc, pierwsza amplifikowana sekwencja jest tą pomiędzy regionami o największej specyficzności startera; najprawdopodobniej jest to sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania. Te fragmenty będą dalej amplifikowane podczas kolejnych rund w niższych temperaturach i będą konkurować z niespecyficznymi sekwencjami, z którymi startery mogą się wiązać w tych niższych temperaturach. Jeśli starter początkowo (podczas faz o wyższej temperaturze) wiąże się z sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania, kolejne rundy reakcji łańcuchowej polimerazy można przeprowadzić na produkcie w celu dalszej amplifikacji tych fragmentów.
Dimery starterów
Przyłączenie końca 3' jednego startera do siebie lub drugiego startera może spowodować wydłużenie startera, w wyniku czego powstają tak zwane dimery starterów, widoczne jako prążki o niskiej masie cząsteczkowej na żelach PCR . Tworzenie dimeru startera często konkuruje z tworzeniem interesującego fragmentu DNA i można tego uniknąć, stosując startery zaprojektowane w taki sposób, że brakuje im komplementarności — zwłaszcza na końcach 3' — sobie lub innemu starterowi użytemu w reakcji. Jeśli projektowanie starterów jest ograniczone innymi czynnikami i jeśli występują dimery starterów, metody ograniczania ich powstawania mogą obejmować optymalizację stężenia MgCl2 lub zwiększenie temperatury hybrydyzacji w reakcji PCR.
Deoksynukleotydy
Deoksynukleotydy (dNTPs) mogą wiązać jony Mg 2+ i tym samym wpływać na stężenie wolnych jonów magnezu w reakcji. Ponadto nadmierne ilości dNTP mogą zwiększać poziom błędów polimerazy DNA, a nawet hamować reakcję. Brak równowagi w proporcjach czterech dNTP może skutkować błędnym włączeniem do nowo utworzonej nici DNA i przyczynić się do zmniejszenia wierności polimerazy DNA.