Denaturacja (biochemia)




Wpływ temperatury na aktywność enzymów . Góra : rosnąca temperatura zwiększa szybkość reakcji ( współczynnik Q10 ). Środek : frakcja sfałdowanego i funkcjonalnego enzymu spada powyżej jego temperatury denaturacji. Dół : w konsekwencji optymalna szybkość reakcji enzymu zachodzi w temperaturze pośredniej.
Definicja IUPAC

Proces częściowej lub całkowitej zmiany natywnej drugorzędowej i/lub trzeciorzędowej i/lub czwartorzędowej struktury białek lub kwasów nukleinowych, powodujący utratę bioaktywności .

Uwaga 1 : Zmodyfikowano definicję podaną w ref.

Uwaga 2 : Denaturacja może wystąpić, gdy białka i kwasy nukleinowe są poddawane działaniu podwyższonej temperatury lub skrajnych wartości pH lub niefizjologicznych stężeń soli, rozpuszczalników organicznych, mocznika lub innych czynników chemicznych.

Uwaga 3 : Enzym traci zdolność do zmiany lub przyspieszenia reakcji chemicznej, gdy jest zdenaturowany.

W biochemii denaturacja jest procesem, w którym białka lub kwasy nukleinowe tracą strukturę czwartorzędową , trzeciorzędową i drugorzędową , która jest obecna w ich stanie natywnym , poprzez zastosowanie pewnego zewnętrznego stresu lub związku, takiego jak mocny kwas lub zasada , skoncentrowany sól nieorganiczna , rozpuszczalnik organiczny (np. alkohol lub chloroform ), mieszanie i promieniowanie lub ciepło . Jeśli białka w żywej komórce są zdenaturowane, powoduje to zakłócenie aktywności komórki i prawdopodobnie śmierć komórki. Denaturacja białek jest również konsekwencją śmierci komórki. Zdenaturowane białka mogą wykazywać szeroki zakres cech, od zmian konformacyjnych i utraty rozpuszczalności do agregacji w wyniku ekspozycji na grupy hydrofobowe . Utrata rozpuszczalności w wyniku denaturacji nazywana jest koagulacją . Zdenaturowane białka tracą swoją trójwymiarową strukturę i dlatego nie mogą funkcjonować.

Fałdowanie białek jest kluczem do tego, czy białko globularne lub błonowe może prawidłowo wykonywać swoją pracę; aby działał, musi być złożony w odpowiedni kształt. Jednak wiązania wodorowe , które odgrywają dużą rolę w zwijaniu, są raczej słabe, a zatem łatwo ulegają wpływowi ciepła, kwasowości, różnych stężeń soli i innych czynników stresogennych, które mogą denaturować białko. Jest to jeden z powodów, dla których homeostaza jest fizjologicznie konieczna w wielu formach życia .

Ta koncepcja nie ma związku z alkoholem denaturowanym , czyli alkoholem, który został zmieszany z dodatkami, aby uczynić go niezdatnym do spożycia przez ludzi.

Typowe przykłady

(Góra) Albumina białkowa w białku jaja ulega denaturacji i utracie rozpuszczalności podczas gotowania jajka. (Na dole) Spinacze zapewniają wizualną analogię, która pomaga w konceptualizacji procesu denaturacji.

Kiedy żywność jest gotowana, niektóre jej białka ulegają denaturacji. To dlatego jajka na twardo twardnieją, a gotowane mięso twardnieje.

Klasyczny przykład denaturacji białek pochodzi z białek jaj, które zazwyczaj składają się głównie z albumin jaj w wodzie. Świeżo z jaj, białka jaj są przezroczyste i płynne. Gotowanie niestabilnych termicznie białek powoduje, że stają się one nieprzezroczyste, tworząc wzajemnie połączoną stałą masę. Tę samą transformację można przeprowadzić za pomocą denaturującej substancji chemicznej. Wlewanie białek jaj do zlewki z acetonem również sprawi, że białka jaj staną się półprzezroczyste i stałe. Skórka, która tworzy się na zsiadłym mleku, jest kolejnym typowym przykładem zdenaturowanego białka. Zimna przekąska znana jako ceviche jest przygotowywana przez chemiczne „gotowanie” surowych ryb i skorupiaków w kwaśnej marynacie cytrusowej, bez użycia ciepła.

Denaturacja białek

Zdenaturowane białka mogą wykazywać szeroki zakres cech, od utraty rozpuszczalności do agregacji białek .

Białka funkcjonalne mają cztery poziomy organizacji strukturalnej:
  1. Struktura pierwszorzędowa: liniowa struktura aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym
  2. Struktura drugorzędowa: wiązania wodorowe między łańcuchami grup peptydowych w helisie alfa lub arkuszu beta
  3. Struktura trzeciorzędowa: trójwymiarowa struktura złożonych helis alfa i helis beta
  4. Struktura czwartorzędowa: trójwymiarowa struktura wielu polipeptydów i ich dopasowanie do siebie
Proces denaturacji:
  1. Białko funkcjonalne o strukturze czwartorzędowej
  2. Pod wpływem ciepła zmienia się wewnątrzcząsteczkowe wiązanie białka
  3. Rozwijanie polipeptydów (aminokwasów)

Tło

Białka lub polipeptydy to polimery aminokwasów . Białko jest tworzone przez rybosomy , które „odczytują” RNA kodowane przez kodony w genie i składają wymaganą kombinację aminokwasów z instrukcji genetycznej w procesie znanym jako translacja . Nowo utworzona nić białkowa przechodzi następnie modyfikację potranslacyjną , w której dodawane są dodatkowe atomy lub cząsteczki , na przykład miedź , cynk lub żelazo . Po zakończeniu tego procesu modyfikacji potranslacyjnej białko zaczyna się fałdować (czasami spontanicznie, a czasem z enzymów ), zwijając się w taki sposób, że elementy hydrofobowe białka są zakopane głęboko w strukturze, a elementy hydrofilowe trafiają na poza. Ostateczny kształt białka określa sposób, w jaki oddziałuje ono z otoczeniem.

Fałdowanie białek polega na równowadze między znaczną ilością słabych oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych w białku (interakcje hydrofobowe, elektrostatyczne i Van Der Waalsa) a interakcjami białko-rozpuszczalnik. W rezultacie proces ten jest silnie zależny od stanu środowiska, w którym znajduje się białko. Te warunki środowiskowe obejmują między innymi temperaturę , zasolenie , ciśnienie i rozpuszczalniki, które są zaangażowane. W konsekwencji każda ekspozycja na ekstremalne obciążenia (np. ciepło lub promieniowanie, wysokie stężenie soli nieorganicznych, mocne kwasy i zasady) może zakłócić interakcję białka i nieuchronnie doprowadzić do denaturacji.

Kiedy białko ulega denaturacji, struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe ulegają zmianie, ale wiązania peptydowe struktury pierwszorzędowej między aminokwasami pozostają nienaruszone. Ponieważ wszystkie poziomy strukturalne białka określają jego funkcję, białko nie może już pełnić swojej funkcji po denaturacji. Kontrastuje to z wewnętrznie nieustrukturyzowanymi białkami , które są rozwinięte w swoim stanie natywnym , ale nadal są aktywne funkcjonalnie i mają tendencję do fałdowania się po związaniu z celem biologicznym.

Jak zachodzi denaturacja na poziomach struktury białek

Zobacz też: Struktura białek

Utrata funkcji

Większość substratów biologicznych traci swoją funkcję biologiczną po denaturacji. Na przykład enzymy tracą swoją aktywność , ponieważ substraty nie mogą już wiązać się z miejscem aktywnym , a reszty aminokwasowe zaangażowane w stabilizowanie stanów przejściowych substratów nie są już ustawione, aby móc to robić. Proces denaturacji i związaną z nim utratę aktywności można mierzyć za pomocą technik, takich jak interferometria z podwójną polaryzacją , CD , QCM-D i MP-SPR .

Utrata aktywności z powodu metali ciężkich i metaloidów

Wiadomo, że celując w białka, metale ciężkie zakłócają funkcję i aktywność białek. Należy zauważyć, że metale ciężkie dzielą się na kategorie obejmujące metale przejściowe, a także wybrane ilości metaloidów. Metale te, wchodząc w interakcję z natywnymi, pofałdowanymi białkami, mają tendencję do odgrywania roli w blokowaniu ich aktywności biologicznej. Ta ingerencja może być przeprowadzona na wiele różnych sposobów. Te metale ciężkie mogą tworzyć kompleksy z funkcjonalnymi grupami łańcuchów bocznych obecnych w białku lub tworzyć wiązania z wolnymi tiolami. Metale ciężkie odgrywają również rolę w utlenianiu łańcuchów bocznych aminokwasów obecnych w białku. Wraz z tym, podczas interakcji z metaloproteinami, metale ciężkie mogą przemieszczać się i zastępować kluczowe jony metali. W rezultacie metale ciężkie mogą zakłócać sfałdowane białka, co może silnie ograniczać stabilność i aktywność białek.

Odwracalność i nieodwracalność

W wielu przypadkach denaturacja jest odwracalna (białka mogą powrócić do stanu natywnego po usunięciu wpływu denaturującego). Proces ten można nazwać renaturacją. To zrozumienie doprowadziło do poglądu, że wszystkie informacje potrzebne białkom do przyjęcia ich stanu natywnego zostały zakodowane w pierwotnej strukturze białka, a zatem w DNA, które koduje białko, tak zwana „ hipoteza termodynamiczna Anfinsena ”.

Denaturacja może być również nieodwracalna. Ta nieodwracalność jest zazwyczaj nieodwracalnością kinetyczną, a nie termodynamiczną, ponieważ zwinięte białko ma na ogół niższą energię swobodną niż wtedy, gdy jest rozłożone. Dzięki nieodwracalności kinetycznej fakt, że białko utknęło w lokalnym minimum, może powstrzymać je przed ponownym fałdowaniem po nieodwracalnej denaturacji.

Denaturacja białka spowodowana pH

Denaturacja może być również spowodowana zmianami pH, które mogą wpływać na chemię aminokwasów i ich reszt. Grupy zdolne do jonizacji w aminokwasach mogą ulegać jonizacji, gdy występują zmiany pH. Zmiana pH na bardziej kwaśne lub bardziej zasadowe może wywołać rozwijanie. Rozwijanie indukowane kwasem często zachodzi między pH 2 a 5, rozwijanie indukowane zasadą zwykle wymaga pH 10 lub wyższego.

Denaturacja kwasu nukleinowego

Główny artykuł: Termodynamika kwasów nukleinowych

Kwasy nukleinowe (w tym RNA i DNA ) to polimery nukleotydów syntetyzowane przez enzymy polimerazy podczas transkrypcji lub replikacji DNA . Po syntezie 5'-3' szkieletu poszczególne zasady azotowe mogą oddziaływać ze sobą poprzez wiązania wodorowe , umożliwiając w ten sposób tworzenie struktur wyższego rzędu. Denaturacja kwasu nukleinowego występuje, gdy wiązanie wodorowe między nukleotydami zostaje przerwane i powoduje oddzielenie wcześniej zgrzewanych nici. Na przykład denaturacja DNA pod wpływem wysokich temperatur powoduje przerwanie par zasad i rozdzielenie dwuniciowej helisy na dwie pojedyncze nici. Nici kwasów nukleinowych są zdolne do ponownej hybrydyzacji, gdy przywracane są „ normalne ” warunki, ale jeśli regeneracja następuje zbyt szybko, nici kwasów nukleinowych mogą ponownie hybrydyzować niedoskonale, co prowadzi do nieprawidłowego parowania zasad.

Denaturacja indukowana biologicznie

Denaturacja DNA występuje, gdy wiązania wodorowe między parami zasad są zaburzone.

Niekowalencyjne interakcje między antyrównoległymi nićmi DNA można przerwać w celu „otwarcia” podwójnej helisy , gdy mają wystąpić biologicznie ważne mechanizmy, takie jak replikacja DNA, transkrypcja, naprawa DNA lub wiązanie białek. Obszar częściowo rozdzielonego DNA jest znany jako bąbel denaturacyjny, który można dokładniej zdefiniować jako otwarcie podwójnej helisy DNA poprzez skoordynowane rozdzielenie par zasad.

Pierwszy model, który próbował opisać termodynamikę bańki denaturacyjnej, został wprowadzony w 1966 roku i nazwany Modelem Polanda-Scheragi. Model ten opisuje denaturację nici DNA jako funkcję temperatury . Wraz ze wzrostem temperatury wiązania wodorowe między parami zasad są coraz bardziej zaburzone i zaczynają tworzyć się „zdenaturowane pętle”. Jednak model Poland-Scheraga jest obecnie uważany za elementarny, ponieważ nie uwzględnia mylących implikacji sekwencji DNA , składu chemicznego, sztywności i skręcania .

Niedawne badania termodynamiczne wykazały, że czas życia pojedynczej bańki denaturacyjnej wynosi od 1 mikrosekundy do 1 milisekundy. Informacje te opierają się na ustalonych skalach czasowych replikacji i transkrypcji DNA. Obecnie [ kiedy? ] Prowadzone są badania biofizyczne i biochemiczne w celu pełniejszego wyjaśnienia termodynamicznych szczegółów bańki denaturacyjnej.

Denaturacja spowodowana czynnikami chemicznymi

Formamid denaturuje DNA poprzez rozerwanie wiązań wodorowych między parami zasad. Pomarańczowe, niebieskie, zielone i fioletowe linie reprezentują odpowiednio adeninę, tyminę, guaninę i cytozynę. Trzy krótkie czarne linie między zasadami a cząsteczkami formamidu reprezentują nowo utworzone wiązania wodorowe.

Ponieważ reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest jednym z najpopularniejszych kontekstów, w których pożądana jest denaturacja DNA, ogrzewanie jest najczęstszą metodą denaturacji. Oprócz denaturacji przez ciepło, kwasy nukleinowe mogą ulegać procesowi denaturacji za pomocą różnych środków chemicznych, takich jak formamid , guanidyna , salicylan sodu , sulfotlenek dimetylu (DMSO), glikol propylenowy i mocznik . Te chemiczne środki denaturujące obniżają temperaturę topnienia (T m ) konkurując o donory i akceptory wiązań wodorowych z istniejącymi wcześniej azotowymi parami zasad . Niektóre środki są w stanie wywołać denaturację nawet w temperaturze pokojowej. Na przykład wykazano, że czynniki alkaliczne (np. NaOH) denaturują DNA poprzez zmianę pH i usuwanie protonów tworzących wiązania wodorowe. Denaturanty te zostały wykorzystane do wytworzenia żelu do elektroforezy w żelu denaturującym w gradiencie (DGGE), który promuje denaturację kwasów nukleinowych w celu wyeliminowania wpływu kształtu kwasu nukleinowego na ich ruchliwość elektroforetyczną .

Denaturacja chemiczna jako alternatywa

Aktywność optyczna (absorpcja i rozpraszanie światła) i właściwości hydrodynamiczne ( dyfuzja translacyjna , współczynniki sedymentacji i czasy korelacji rotacyjnej ) kwasów nukleinowych zdenaturowanych formamidem są podobne do kwasów nukleinowych zdenaturowanych termicznie. Dlatego też, w zależności od pożądanego efektu, chemiczna denaturacja DNA może zapewnić łagodniejszą procedurę denaturacji kwasów nukleinowych niż denaturacja wywołana ciepłem. Badania porównujące różne metody denaturacji, takie jak ogrzewanie, młyn kulowy o różnych rozmiarach kulek, sonikacja sondy i denaturacja chemiczna pokazują, że denaturacja chemiczna może zapewnić szybszą denaturację w porównaniu z innymi opisanymi metodami denaturacji fizycznej. Szczególnie w przypadkach, gdy pożądana jest szybka renaturacja, chemiczne środki denaturujące mogą stanowić idealną alternatywę dla ogrzewania. Na przykład nici DNA zdenaturowane środkami alkalicznymi , takimi jak NaOH , renaturują się natychmiast po dodaniu buforu fosforanowego .

Denaturacja spowodowana powietrzem

Małe, elektroujemne cząsteczki, takie jak azot i tlen , które są głównymi gazami w powietrzu , znacząco wpływają na zdolność otaczających cząsteczek do udziału w tworzeniu wiązań wodorowych . Cząsteczki te konkurują z otaczającymi akceptorami wiązań wodorowych o donory wiązań wodorowych, działając w ten sposób jako „łamacze wiązań wodorowych” i osłabiając interakcje między otaczającymi cząsteczkami w środowisku. Nici antyrównoległe w podwójnych helisach DNA są związane niekowalencyjnie przez wiązania wodorowe między parami zasad; azot i tlen zachowują zatem potencjał osłabiania integralności DNA po wystawieniu na działanie powietrza. W rezultacie nici DNA wystawione na działanie powietrza wymagają mniejszej siły do ​​rozdzielenia i stanowią przykład niższych temperatur topnienia .

Aplikacje

Wiele technik laboratoryjnych opiera się na zdolności rozdzielania nici kwasu nukleinowego. Dzięki zrozumieniu właściwości denaturacji kwasów nukleinowych powstały następujące metody:

denaturaty

Denaturanty białek

Kwasy

Kwaśne denaturanty białek obejmują:

Bazy

Zasady działają podobnie do kwasów w denaturacji. Zawierają:

Rozpuszczalniki

Większość rozpuszczalników organicznych jest denaturujących, w tym: [ potrzebne źródło ]

Odczynniki sieciujące

sieciujące białka obejmują: [ potrzebne źródło ]

Środki chaotropowe

Czynniki chaotropowe obejmują: [ potrzebne źródło ]

Reduktory wiązań dwusiarczkowych

Środki, które rozbijają wiązania dwusiarczkowe poprzez redukcję, obejmują: [ potrzebne źródło ]

Czynniki reaktywne chemicznie

Czynniki takie jak nadtlenek wodoru, chlor pierwiastkowy, kwas podchlorawy (woda z chlorem), brom, woda bromowa, jod, kwasy azotowy i utleniający oraz ozon reagują z wrażliwymi cząsteczkami, takimi jak siarczek/tiol, aktywowane pierścienie aromatyczne (fenyloalanina), w efekcie uszkadzając białko i czyni je bezużytecznymi.

Inny

Denaturanty kwasu nukleinowego

Chemiczny

Kwaśne denaturanty kwasów nukleinowych obejmują:

Podstawowe denaturanty kwasów nukleinowych obejmują:

  • NaOH

Inne denaturanty kwasów nukleinowych obejmują:

Fizyczny

Zobacz też

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Denaturation_(biochemistry)&oldid=1131262138 ”