PCR zależny od RNazy H
PCR zależny od RNazy H (rhPCR) jest modyfikacją standardowej techniki PCR . W rhPCR startery są zaprojektowane z usuwalnym blokiem amplifikacji na końcu 3'. Amplifikacja zablokowanego startera zależy od aktywności cięcia hipertermofilnego enzymu RNazy H typu II z archeonów podczas hybrydyzacji z komplementarną sekwencją docelową. Ten enzym RNaza H posiada kilka użytecznych właściwości, które wzmacniają PCR. Po pierwsze, ma bardzo małą aktywność enzymatyczną w niskiej temperaturze, umożliwiając „ hot start PCR ” bez modyfikacji polimeraza DNA . Po drugie, wydajność cięcia enzymu jest zmniejszona w obecności niedopasowań w pobliżu reszty RNA. Pozwala to na zmniejszenie dimerów starterów , wykrywanie alternatywnych wariantów splicingu, możliwość przeprowadzenia multipleksowej PCR z większą liczbą starterów PCR oraz zdolność do wykrywania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów .
Zasada
Startery rhPCR składają się z trzech części. 1) Odcinek DNA 5', równoważny długości i temperaturze topnienia (Tm) wymaganej dla standardowego startera do PCR, jest wydłużany po rozszczepieniu przez enzym RNazę HII. 2) Pojedyncza zasada RNA zapewnia miejsce cięcia dla RNazy HII. 3) Krótkie przedłużenie 3' o czterech lub pięciu zasadach, po którym następuje bloker (zwykle krótka, nierozciągliwa cząsteczka, taka jak propanodiol ) zapobiega wydłużaniu przez polimerazę DNA aż do usunięcia. Reakcja rhPCR rozpoczyna się od starterów i matrycy w roztworze (Rysunek 1). Chociaż te startery są wolne w roztworze, nie są odblokowywane przez enzym RNazę HII, ponieważ muszą znajdować się w heterodupleksie RNA:DNA z matrycą do rozszczepienia. Po związaniu z matrycą startery rhPCR są rozszczepiane przez termostabilny enzym RNazę HII. To usuwa blok, umożliwiając polimerazie DNA wysunięcie się ze starterów. Cykliczna reakcja PCR kontynuuje proces. Startery rhPCR są zaprojektowane w taki sposób, że po rozszczepieniu przez enzym RNazę H2, Tm starterów są nadal większe niż temperatura hybrydyzacji reakcji PCR. Startery te można stosować zarówno w nukleazie 5' Typy ilościowego PCR Taqman i SYBR Green .
Aplikacje
rhPCR może być używany do ilościowego PCR oraz laboratoriów medycznych lub środowiskowych: