ROZWIĄZANIE

RESOLFT , skrót od REversible S aturable Optica L Fluorescent Transitions , oznacza grupę technik optycznej mikroskopii fluorescencyjnej o bardzo wysokiej rozdzielczości . Stosując standardową optykę światła widzialnego dalekiego pola , można uzyskać rozdzielczość znacznie poniżej granicy dyfrakcji aż do skali molekularnej.

Przy użyciu konwencjonalnych technik mikroskopowych nie jest możliwe rozróżnienie cech, które znajdują się w odległościach mniejszych niż około połowa stosowanej długości fali (tj. około 200 nm dla światła widzialnego ). Ta granica dyfrakcji opiera się na falowej naturze światła . W konwencjonalnych mikroskopach granicę wyznacza się na podstawie użytej długości fali i apertury numerycznej układu optycznego. Koncepcja RESOLFT pokonuje tę granicę, tymczasowo przełączając cząsteczki do stanu, w którym nie mogą wysłać sygnału (fluorescencyjnego) po oświetleniu. Koncepcja ta różni się od na przykład mikroskopii elektronowej , gdzie zamiast tego stosowana długość fali jest znacznie mniejsza.

Zasada działania

Włączanie i wyłączanie fluorescencji w określonych obszarach powoduje włączenie fluorescencji w obszarach mniejszych niż granica dyfrakcyjna. Rasteryzacja całej próbki daje obraz pikselowy o wyjątkowo wysokiej rozdzielczości.

Mikroskopia RESOLFT to mikroskopia optyczna o bardzo wysokiej rozdzielczości, która umożliwia obrazowanie szczegółów w próbkach, których nie można sfotografować za pomocą mikroskopii konwencjonalnej lub konfokalnej . W ramach RESOLFT uogólniono zasady mikroskopii STED i mikroskopii GSD . Struktury, które zwykle są zbyt blisko siebie, aby je rozróżnić, są odczytywane sekwencyjnie.

W tym kontekście można wyjaśnić wszystkie metody, które działają na cząsteczkach, które mają co najmniej dwa rozróżnialne stany, w których możliwe jest odwracalne przełączanie między dwoma stanami i gdzie co najmniej jedno takie przejście może być indukowane optycznie.

W większości przypadków stosuje się markery fluorescencyjne, gdzie jeden stan (A) jest jasny, czyli generuje sygnał fluorescencyjny, a drugi stan (B) jest ciemny i nie daje żadnego sygnału. Jedno przejście pomiędzy nimi może być wywołane światłem (np. A → B, jasny do ciemnego).

Próbka jest oświetlona niejednorodnie, przy czym intensywność oświetlenia w jednym miejscu jest bardzo mała (zero w idealnych warunkach). Tylko w tym miejscu cząsteczki nigdy nie znajdują się w stanie ciemnym B (jeśli A jest stanem istniejącym wcześniej) i pozostają całkowicie w stanie jasnym A. Obszar, w którym cząsteczki znajdują się głównie w stanie jasnym, może być bardzo mały (mniejszy niż konwencjonalnej granicy dyfrakcyjnej) poprzez zwiększenie natężenia światła przejściowego (patrz poniżej). Wiadomo zatem, że każdy wykryty sygnał pochodzi wyłącznie od cząsteczek znajdujących się na małym obszarze wokół minimum natężenia oświetlenia. Obraz o wysokiej rozdzielczości można skonstruować skanując próbkę, czyli przesuwając profil oświetlenia po powierzchni.

Przejście z powrotem z B do A może być spontaniczne lub spowodowane światłem o innej długości fali. Cząsteczki muszą być przełączalne kilka razy, aby podczas skanowania próbki znajdowały się w stanie A lub B w różnych momentach. Metoda działa również w przypadku odwrócenia stanu jasnego i ciemnego, wówczas uzyskuje się obraz negatywowy.

Rozdzielczość poniżej granicy dyfrakcji

Zasada RESOLFT: Próbka jest oświetlona niejednorodnie (czerwona linia). Intensywność jest zmniejszana w obszarze porównywalnym z klasyczną granicą rozdzielczości, ale (w idealnym przypadku) wynosi zero tylko w jednym miejscu. Intensywność progowa (niebieska linia) wymagana do przełączenia cząsteczek w stan ciemny to tylko ułamek maksymalnej zastosowanej intensywności, więc tylko cząsteczki bardzo blisko pozycji minimalnej intensywności mogą znajdować się w stanie jasnym. Zielony obszar w prawej ramce ilustruje wielkość obszaru, w którym cząsteczki są w stanie wygenerować sygnał.

W RESOLFT obszar, w którym cząsteczki znajdują się w stanie A (stan jasny), można dowolnie zmniejszyć pomimo granicy dyfrakcji.

• Należy oświetlić próbkę niejednorodnie, tak aby powstał izolowany punkt o zerowej intensywności. Można to osiągnąć np. poprzez interferencję.
• Przy niskich intensywnościach (niższych niż niebieska linia na obrazku) większość cząsteczek markerów jest w stanie jasnym, jeśli intensywność jest wyższa, większość markerów jest w stanie ciemnym.

Przy słabym oświetleniu widzimy, że obszar, w którym cząsteczki pozostają w stanie A, jest nadal dość duży, ponieważ oświetlenie jest tak słabe, że większość cząsteczek znajduje się w stanie A. Kształt profilu oświetlenia nie wymaga zmiany. Zwiększenie jasności oświetlenia skutkuje już mniejszym obszarem, na którym intensywność jest niższa od wartości umożliwiającej skuteczne przejście do stanu ciemnego. W rezultacie zmniejsza się również obszar, w którym cząsteczki mogą znajdować się w stanie A. Sygnał (fluorescencji) podczas kolejnego odczytu pochodzi z bardzo małej plamki i można uzyskać bardzo ostre obrazy.

W koncepcji RESOLFT rozdzielczość można przybliżyć za pomocą wzoru ${\ displaystyle \ Delta d \ simeq {\ frac {\ lambda} {\ pi n {\ sqrt {\ frac {I} {Isat}}}}}}$$,$ gdzie intensywnością wymaganą do nasycenia przejścia (połowa cząsteczek pozostaje w stanie A, a połowa w stanie B) ${ \displaystyle ja}$ oznacza zastosowaną intensywność. Jeśli minima są wytwarzane przez skupianie optyki z aperturą numeryczną , $z$ której można rozpoznać dwa identyczne ${\ Displaystyle \ Delta d = {\ Frac {\ lambda} {2n \ cdot \ sin \ alfa \ cdot {\ sqrt {1 + {\ Frac$ co można uznać za rozszerzenie równania Abbego . Nieograniczony dyfrakcyjnie $\frac {I}{Isat}}}$ rodziny pojęć RESOLFT znajduje odzwierciedlenie w fakcie, że minimalną rozpoznawalną odległość $Delta d}$ Δ $displaystyle \$ . Stąd poszukiwanie rozdzielczości w nanoskali sprowadza się do maksymalizacji tej wielkości. Jest to możliwe poprzez $obniżenie$ lub ${\ displaystyle I_ {sat}$ }

Warianty

Do przełączania stanów molekularnych stosuje się różne procesy. Jednak wspólną cechą wszystkich jest to, że stosowane są co najmniej dwa rozróżnialne stany. Zwykle stosowana właściwość fluorescencji pozwala na rozróżnienie stanów, jednak nie jest to istotne, ponieważ można również wykorzystać właściwości absorpcji lub rozpraszania.

Mikroskopia STED

(Główny artykuł mikroskopia STED )

W mikroskopii STED (mikroskopia STimulated Emission Depletion) cząsteczka barwnika fluorescencyjnego jest przemieszczana pomiędzy swoim elektronicznym stanem podstawowym a stanem wzbudzonym, wysyłając fotony fluorescencyjne. Jest to standardowy tryb pracy w mikroskopii fluorescencyjnej i przedstawia stan A. W stanie B barwnik jest trwale utrzymywany w podstawowym stanie elektronicznym poprzez emisję wymuszoną . Jeśli barwnik może fluoryzować w stanie A, a nie w stanie B, obowiązuje koncepcja RESOLFT.

Mikroskopia GSD

(Główny artykuł mikroskopia GSD )

Mikroskopia GSD (mikroskopia zubożenia stanu podstawowego) wykorzystuje również markery fluorescencyjne. W stanie A cząsteczka może swobodnie przemieszczać się pomiędzy masą a pierwszym stanem wzbudzonym i może być wysyłana fluorescencja. W stanie ciemnym B stan podstawowy cząsteczki ulega depopulacji, następuje przejście do stanu wzbudzonego o długim czasie trwania, z którego nie jest emitowana fluorescencja. Dopóki cząsteczka jest w stanie ciemnym, nie jest dostępna do przełączania między stanem podstawowym a stanem wzbudzonym, w związku z czym fluorescencja jest wyłączona.

SPEM i SSIM

SPEM (mikroskopia ze wzbudzeniem nasyconym) i SSIM (mikroskopia z nasyceniem strukturalnym) wykorzystują koncepcję RESOLFT, wykorzystując wzbudzenie nasycone do tworzenia obrazów „negatywnych”, tj. fluorescencja występuje wszędzie z wyjątkiem bardzo małego obszaru wokół geometrycznego ogniska mikroskopu. Do oświetlenia wykorzystywane są również wzory inne niż punktowe. Aby ponownie uzyskać pozytywne obrazy, konieczna jest matematyczna rekonstrukcja obrazu.

RESOLFT z przełączalnymi białkami

Niektóre białka fluorescencyjne można włączać i wyłączać za pomocą światła o odpowiedniej długości fali. Można je stosować w mikroskopie typu RESOLFT. Podczas naświetlania światłem białka te zmieniają swoją konformację. W tym procesie zyskują lub tracą zdolność emitowania fluorescencji. Stan fluorescencji odpowiada stanowi A, brak fluorescencji stanowi B i ponownie obowiązuje koncepcja RESOLFT. Odwracalne przejście (np. z B z powrotem do A) następuje albo samoistnie, albo ponownie pod wpływem światła. Indukowanie zmian konformacyjnych w białkach można osiągnąć już przy znacznie niższych natężeniach światła przełączającego w porównaniu do emisji wymuszonej lub zubożenia stanu podstawowego (kilka W/cm²). W połączeniu z z mikroskopu 4Pi o rozdzielczości izotropowej poniżej 40 nm wykonano dla żywych komórek przy słabym oświetleniu.

RESOLFT z wymiennymi barwnikami organicznymi

Podobnie jak w przypadku białek, również niektóre barwniki organiczne mogą zmieniać swoją strukturę pod wpływem światła. Zdolność do fluorescencji takich barwników organicznych można włączać i wyłączać za pomocą światła widzialnego. Ponownie zastosowane natężenie światła może być dość niskie (około 100 W/cm²).