Mikroskop 4Pi

Mikroskop 4Pi to laserowy skaningowy mikroskop fluorescencyjny o ulepszonej rozdzielczości osiowej . Dzięki niemu typowy zakres rozdzielczości osiowej 500–700 nm można poprawić do 100–150 nm, co odpowiada prawie kulistemu ognisku o 5–7 razy mniejszej objętości niż standardowa mikroskopia konfokalna .

Zasada działania

Poprawę rozdzielczości uzyskuje się dzięki zastosowaniu dwóch przeciwstawnych soczewek obiektywowych, które są ogniskowane w tym samym miejscu geometrycznym. Również różnica w długości drogi optycznej przez każdą z dwóch soczewek obiektywowych jest starannie dostosowana, aby była minimalna. Dzięki tej metodzie cząsteczki znajdujące się we wspólnym obszarze ogniskowym obu obiektywów mogą być oświetlane koherentnie z obu stron, a światło odbite lub emitowane może być również koherentnie zbierane, tj. możliwe jest koherentne nałożenie emitowanego światła na detektor. Kąt bryłowy , który jest używany do oświetlenia i $wykrywania,$ się i zbliża się do maksimum. W tym przypadku próbka jest oświetlana i wykrywana ze wszystkich stron jednocześnie.

Schemat optyczny mikroskopu 4Pi

Tryb pracy mikroskopu 4Pi pokazano na rysunku. Światło lasera jest rozdzielane przez rozdzielacz wiązki i kierowane przez zwierciadła w kierunku dwóch przeciwległych soczewek obiektywów. We wspólnym ognisku zachodzi superpozycja obu skupionych wiązek światła. Wzbudzone cząsteczki w tej pozycji emitują światło fluorescencyjne, które jest zbierane przez obie soczewki obiektywu, łączone przez ten sam rozdzielacz wiązki i odbijane przez lustro dichroiczne na detektor. Tam ponownie może dojść do superpozycji obu emitowanych dróg światła.

W idealnym przypadku każda soczewka obiektywu może zbierać światło pod kątem bryłowym ${\ Displaystyle \ Omega = 2 \ pi}$ . Mając dwie soczewki obiektywowe, można zbierać z każdego kierunku (kąt bryłowy ${\ Displaystyle \ Omega = 4 \ pi}$ ). Nazwa tego typu mikroskopii pochodzi od maksymalnego możliwego kąta bryłowego dla wzbudzenia i detekcji. Praktycznie dla obiektywu można osiągnąć tylko kąty apertury około 140 °, co odpowiada ${\ Displaystyle \ Omega \ około 1,3 \ pi$ }

Mikroskop może pracować na trzy różne sposoby: W mikroskopie 4Pi typu A do generowania zwiększonej rozdzielczości wykorzystywana jest koherentna superpozycja światła wzbudzającego. Światło emisyjne jest wykrywane albo tylko z jednej strony, albo w niespójnej superpozycji z obu stron. W mikroskopie 4Pi typu B zakłóceniem jest tylko światło emisyjne. Podczas pracy w trybie typu C zarówno światło wzbudzające, jak i emitujące mogą interferować, co prowadzi do najwyższego możliwego wzrostu rozdzielczości (~7-krotnego wzdłuż osi optycznej w porównaniu z mikroskopią konfokalną).

W prawdziwym mikroskopie 4Pi światło nie może być równomiernie przyłożone ani zbierane ze wszystkich kierunków, co prowadzi do powstania tzw. listków bocznych w funkcji rozproszenia punktowego . Zazwyczaj (ale nie zawsze) mikroskopia wzbudzenia dwufotonowego jest używana w mikroskopie 4Pi w połączeniu z otworem emisyjnym w celu obniżenia tych płatków bocznych do dopuszczalnego poziomu.

Historia

W 1971 roku Christoph Cremer i $, który przenosi informacje o całym polu emisji źródła punktowego we wszystkich$ Cremer zaproponowali stworzenie idealnego hologramu , czyli takiego , tak zwanego hologramu. Jednak publikacja z 1978 roku wyciągnęła niewłaściwy wniosek fizyczny (tj. punktową plamkę światła) i całkowicie pominęła wzrost rozdzielczości osiowej jako rzeczywistą korzyść dodania drugiej strony kąta bryłowego. Pierwszy opis praktycznego systemu mikroskopii 4Pi, tj. układu z dwiema przeciwstawnymi, interferencyjnymi soczewkami, został wynaleziony przez Stefana Hella w 1991 roku. Zademonstrował go eksperymentalnie w 1994 roku.

W kolejnych latach liczba zastosowań tego mikroskopu rosła. Na przykład równoległe wzbudzanie i detekcja z 64 plamkami w próbce jednocześnie w połączeniu z lepszą rozdzielczością przestrzenną zaowocowało pomyślnym zarejestrowaniem dynamiki mitochondriów w komórkach drożdży za pomocą mikroskopu 4Pi w 2002 r. Wersja komercyjna została wprowadzona na rynek przez producenta mikroskopów Leica Microsystems w 2004 roku i później przerwane.

Do tej pory najlepszą jakość w mikroskopie 4Pi osiągano w połączeniu z technikami superrozdzielczości, takimi jak zasada stymulowanego wyczerpywania emisji (STED). Używając mikroskopu 4Pi z odpowiednimi wiązkami wzbudzenia i dewzbudzenia, możliwe było utworzenie plamki o jednakowej wielkości 50 nm, co odpowiada zmniejszonej objętości ogniskowej w porównaniu z mikroskopią konfokalną o współczynnik 150–200 w utrwalonych komórkach. Dzięki połączeniu mikroskopii 4Pi i RESOLFT z przełączalnymi białkami możliwe jest teraz wykonywanie zdjęć żywych komórek przy słabym oświetleniu z rozdzielczością izotropową poniżej 40 nm.

Zobacz też

• Mikroskop zubożenia emisji wymuszonej (STED)
• Wieloogniskowa mikroskopia płaska (MUM)