Pirosekwencjonowanie

Pirosekwencjonowanie to metoda sekwencjonowania DNA (określania kolejności nukleotydów w DNA) oparta na zasadzie „sekwencjonowania przez syntezę”, w której sekwencjonowanie odbywa się poprzez wykrywanie nukleotydu wbudowanego przez polimerazę DNA . Pirosekwencjonowanie polega na wykrywaniu światła w oparciu o reakcję łańcuchową uwalniania pirofosforanu . Stąd nazwa pirosekwencjonowanie.

Zasada pirosekwencjonowania została po raz pierwszy opisana w 1993 roku przez Bertila Petterssona, Mathiasa Uhlena i Påla Nyrena poprzez połączenie metody sekwencjonowania w fazie stałej przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną z rekombinowaną polimerazą DNA pozbawioną aktywności egzonukleazy 3´do 5´ (korekta) i luminescencji wykrywanie za pomocą enzymu lucyferazy świetlika . Mieszanina trzech enzymów ( polimerazy DNA , sulfurylazy ATP i lucyferazy świetlika ) oraz nukleotydu ( dNTP ) dodaje się do jednoniciowego DNA w celu sekwencjonowania, a po włączeniu nukleotydu dokonuje się pomiaru emitowanego światła. Intensywność światła określa, czy włączono 0, 1 lub więcej nukleotydów, pokazując w ten sposób, ile komplementarnych nukleotydów jest obecnych na nici matrycy. Mieszaninę nukleotydów usuwa się przed dodaniem następnej mieszaniny nukleotydów. Ten proces jest powtarzany dla każdego z czterech nukleotydów, aż do określenia sekwencji DNA jednoniciowej matrycy.

Druga metoda pirosekwencjonowania oparta na roztworach została opisana w 1998 roku przez Mostafę Ronaghi , Mathiasa Uhlena i Påla Nyrena . W tej alternatywnej metodzie wprowadza się dodatkowy enzym apirazę w celu usunięcia nukleotydów, które nie są włączane przez polimerazę DNA. Umożliwiło to powstanie mieszaniny enzymów obejmującej polimerazę DNA , lucyferazę i apirazę należy dodać na początku i zachować przez cały czas trwania procedury, zapewniając w ten sposób prostą konfigurację odpowiednią do automatyzacji. Zautomatyzowany instrument oparty na tej zasadzie został wprowadzony na rynek w następnym roku przez firmę Pyrosequencing.

Trzeci mikroprzepływowy wariant metody pirosekwencjonowania został opisany w 2005 roku przez Jonathana Rothberga i współpracowników firmy 454 Life Sciences . To alternatywne podejście do pirosekwencjonowania opierało się na pierwotnej zasadzie przyłączania DNA przeznaczonego do sekwencjonowania do stałego podłoża i wykazało, że sekwencjonowanie można przeprowadzić w wysoce równoległy sposób przy użyciu mikromacierzy mikrofabrykowanej . Pozwoliło to na wysokowydajne sekwencjonowanie DNA, a na rynek wprowadzono zautomatyzowane urządzenie. Stało się to pierwszym instrumentem do sekwencjonowania nowej generacji, rozpoczynającym nową erę genomicznych , przy gwałtownie spadających cenach sekwencjonowania DNA, co umożliwia sekwencjonowanie całego genomu po przystępnych cenach.

Procedura

Wykres pokazuje, jak działa pirosekwencjonowanie.

„Sekwencjonowanie przez syntezę” obejmuje pobranie pojedynczej nici DNA do sekwencjonowania, a następnie enzymatyczną syntezę jej komplementarnej nici. Metoda pirosekwencjonowania polega na wykrywaniu aktywności polimerazy DNA (enzymu syntetyzującego DNA) z innym enzymem chemoluminescencyjnym . Zasadniczo metoda umożliwia sekwencjonowanie pojedynczej nici DNA poprzez syntezę komplementarnej nici wzdłuż niej, po jednej parze zasad i wykrywanie, która zasada została faktycznie dodana na każdym etapie. Matryca DNA jest nieruchoma, a roztwory nukleotydów A, C, G i T są kolejno dodawane i usuwane z reakcji. Światło jest wytwarzane tylko wtedy, gdy roztwór nukleotydu uzupełnia pierwszą niesparowaną zasadę matrycy. Sekwencja roztworów, które wytwarzają sygnały chemiluminescencyjne, pozwala na określenie sekwencji matrycy.

W wersji pirosekwencjonowania opartej na roztworze, matryca jednoniciowego DNA ( ssDNA ) jest hybrydyzowana ze starterem do sekwencjonowania i inkubowana z enzymami polimerazy DNA , sulfurylazy ATP , lucyferazy i apyrazy oraz z substratami 5´-fosfosiarczanem adenozyny (APS) i lucyferyna .

1. Dodanie jednego z czterech trójfosforanów dezoksynukleotydów ( dNTP ) (dATPαS, który nie jest substratem dla lucyferazy, dodaje się zamiast dATP, aby uniknąć szumu) inicjuje drugi etap. Polimeraza DNA włącza prawidłowe, komplementarne dNTP do matrycy. To włączenie uwalnia pirofosforan (PPi).
2. Sulurylaza ATP przekształca PPi w ATP w obecności 5´fosfosiarczanu adenozyny. Ten ATP działa jako substrat dla pośredniczonej przez lucyferazę konwersji lucyferyny do oksylucyferyny, która generuje światło widzialne w ilościach proporcjonalnych do ilości. Światło wytwarzane w reakcji katalizowanej lucyferazą jest wykrywane przez kamerę i analizowane w programie.
3. Niewbudowane nukleotydy i ATP są rozkładane przez apyrazę , a reakcja może rozpocząć się ponownie z innym nukleotydem.

Proces ten można przedstawić za pomocą następujących równań:

• PPi + APS → ATP + Siarczan (katalizowany przez ATP-sulfurylazę);
• ATP + lucyferyna + O2 → AMP + PPi + oksylucyferyna + CO2 + hv (katalizowana przez lucyferazę);

Gdzie:

• PPi to pirofosforan
• APS to 5-fosforan adenozyny;
• ATP to trójfosforan adenozyny;
• O2 to cząsteczka tlenu;
• AMP to monofosforan adenozyny;
• CO2 to dwutlenek węgla;
• hv jest lekki.

Ograniczenia

Obecnie ograniczeniem tej metody jest to, że długości poszczególnych odczytów sekwencji DNA mieszczą się w okolicach 300-500 nukleotydów, czyli są krótsze niż 800-1000 uzyskiwane metodami terminacji łańcucha (np. sekwencjonowanie Sangera). Może to utrudnić proces składania genomu , szczególnie w przypadku sekwencji zawierających dużą ilość powtarzalnego DNA . Brak działań korekcyjnych ogranicza dokładność tej metody.

Komercjalizacja

Firma Pyrosequencing AB w Uppsali w Szwecji została założona dzięki kapitałowi podwyższonego ryzyka zapewnionemu przez HealthCap w celu komercjalizacji maszyn i odczynników do sekwencjonowania krótkich odcinków DNA przy użyciu techniki pirosekwencjonowania. Pyrosequencing AB jest notowana na Giełdzie Papierów Wartościowych w Sztokholmie w 1999 r. W 2003 r. Zmieniono jej nazwę na Biotage. Linia biznesowa pirosekwencjonowania została przejęta przez Qiagen w 2008 r. Licencję na technologię pirosekwencjonowania otrzymało 454 Life Sciences . 454 opracował technologię pirosekwencjonowania opartą na macierzach, która pojawiła się jako platforma do sekwencjonowania DNA na dużą skalę , w tym sekwencjonowania genomu i metagenomiki .

Roche ogłosił wycofanie platformy sekwencjonowania 454 w 2013 roku.

Dalsza lektura

•   Metzker M. (2005). „Nowe technologie w sekwencjonowaniu DNA” . Badania genomu . 15 (12): 1767–76. doi : 10.1101/gr.3770505 . PMID 16339375 .