Profilowanie polisomów
Profilowanie polisomów to technika stosowana w biologii molekularnej do badania powiązań mRNA z rybosomami . Należy zauważyć, że technika ta różni się od profilowania rybosomów . Obie techniki zostały poddane przeglądowi i obie są stosowane w analizie translatomu , ale generowane przez nie dane mają bardzo różny poziom szczegółowości. Technika ta jest niezwykle powtarzalna w przypadku stosowania przez ekspertów: 3 profile na pierwszym zdjęciu pochodzą z 3 różnych eksperymentów.
Procedura
Procedura rozpoczyna się od sporządzenia lizatu komórek będących przedmiotem zainteresowania. Lizat ten zawiera polisomy , monosomy (złożone z jednego rybosomu znajdującego się na mRNA ), małe (40S u eukariontów ) i duże (60S u eukariontów) podjednostki rybosomalne, „wolny” mRNA i wiele innych rozpuszczalnych składników komórkowych.
Procedurę kontynuuje się, wykonując w probówce wirówkowej ciągły gradient sacharozy o stale zmiennej gęstości . W zastosowanych stężeniach (w przykładzie 15-45%) sacharoza nie zakłóca asocjacji rybosomów i mRNA. Część gradientu 15% znajduje się na górze rurki, podczas gdy część 45% znajduje się na dole ze względu na różną gęstość .
Określoną ilość (mierzoną na podstawie gęstości optycznej ) lizatu następnie delikatnie nakłada się warstwami na gradient w probówce. Lizat, mimo że zawiera dużą ilość rozpuszczalnego materiału, ma znacznie mniejszą gęstość niż 15% sacharozy, dlatego można go przechowywać jako osobną warstwę na górze probówki, jeśli zrobi się to delikatnie.
W celu rozdzielenia składników lizatu preparat poddaje się wirowaniu. Przyspiesza to składniki lizatu z wielokrotnie większą siłą grawitacji , a tym samym przemieszcza je przez gradient w zależności od tego, jak „duże” są poszczególne składniki. Małe podjednostki (40S) przemieszczają się mniej daleko w gradient niż duże podjednostki (60S). Rybsomy 80S w mRNA przemieszczają się dalej (należy zauważyć, że udział wielkości mRNA w przebytej odległości nie jest znaczący). Polisomy złożone z 2 rybosomów podróżują dalej, polisomy z 3 rybosomami podróżują jeszcze dalej i tak dalej. „Rozmiar” komponentów jest oznaczony przez S, the jednostka Svedberga . Zauważ, że jeden S = 10-13 sekund i że pojęcie „duży” jest w rzeczywistości nadmiernym uproszczeniem.
Po odwirowaniu zawartość probówki zbiera się jako frakcje od góry (mniejsze, wolniej przemieszczające się) do dołu (większe, szybciej przemieszczające się) i określa gęstość optyczną frakcji. Pierwsze usunięte frakcje zawierają dużą ilość stosunkowo małych cząsteczek, takich jak tRNA, pojedyncze białka itp.
Aplikacje
Możliwe jest zastosowanie tej techniki do badania ogólnego stopnia translacji w komórkach (na przykład), ale można ją zastosować znacznie bardziej szczegółowo do badania poszczególnych białek i ich mRNA. Jako przykład pokazano w dolnej części rysunku, białko tworzące część małej podjednostki można najpierw wykryć we frakcji 40S, następnie prawie znika z frakcji 60S (odstępy na tych gradientach nie są absolutne), a następnie pojawia się ponownie we frakcjach 80S i polisomalnych. Oznacza to, że w komórce znajduje się co najwyżej bardzo niewiele białka, które nie jest częścią małej podjednostki. Natomiast w górnym rzędzie immunoblotu rozpuszczalne białko pojawia się we frakcjach rozpuszczalnych i jest związane z rybosomami i polisomami. Konkretne białko to a białko opiekuńcze , które (w skrócie) pomaga w fałdowaniu powstającego peptydu podczas jego wytłaczania z rybosomu. Jak inna praca
w artykule wykazano bezpośrednie powiązanie białka opiekuńczego z rybosomem.
Technikę tę można również zastosować do badania stopnia translacji konkretnego mRNA. W tych doświadczeniach badano sekwencje 5' i 3' mRNA pod kątem ich wpływu na ilość wytwarzanego mRNA i jakość translacji mRNA. Jak pokazano, nie wszystkie izoformy mRNA ulegają translacji z taką samą wydajnością, mimo że ich sekwencje kodujące są takie same.