Profilowanie sekwencji końcowej

Profilowanie sekwencji końcowej (ESP) (czasami „mapowanie sparowanych końców (PEM)”) to metoda oparta na złączach oznaczonych sekwencją, opracowana w celu ułatwienia sekwencjonowania genomu de novo w celu identyfikacji liczby kopii w wysokiej rozdzielczości i aberracji strukturalnych, takich jak inwersje i translokacje .

Przepływ pracy profilowania sekwencji końcowej

Pokrótce, docelowy genomowy DNA jest izolowany i częściowo trawiony enzymami restrykcyjnymi na duże fragmenty. Po frakcjonowaniu pod względem wielkości fragmenty są klonowane do plazmidów w celu skonstruowania sztucznych chromosomów, takich jak sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC), które są następnie sekwencjonowane i porównywane z genomem odniesienia. Różnice, w tym różnice w orientacji i długości między skonstruowanymi chromosomami a genomem referencyjnym, będą sugerować liczbę kopii i aberrację strukturalną.

Sztuczna konstrukcja chromosomu

Przepływ pracy przy budowie sztucznego chromosomu bakterii

Przed analizą aberracji strukturalnej docelowego genomu i zmienności liczby kopii (CNV) za pomocą ESP, docelowy genom jest zwykle amplifikowany i konserwowany za pomocą sztucznej konstrukcji chromosomu. Klasyczną strategią konstruowania sztucznego chromosomu jest sztuczny chromosom bakteryjny (BAC). Zasadniczo docelowy chromosom jest losowo trawiony i wstawiany do plazmidów, które są transformowane i klonowane w bakteriach. Rozmiar wstawianych fragmentów wynosi 150–350 kb. Innym powszechnie stosowanym sztucznym chromosomem jest fosmid. Różnica między BAC a kosmidami polega na wielkości wstawionego DNA. Fosmidy mogą zawierać tylko fragmenty DNA o wielkości 40 kb, co pozwala na dokładniejsze określenie punktu przerwania.

Wykrywanie aberracji strukturalnej

Profilowanie sekwencji końcowej (ESP) można wykorzystać do wykrywania zmian strukturalnych, takich jak insercje, delecje i rearanżacje chromosomów. W porównaniu z innymi metodami, które badają nieprawidłowości chromosomalne, ESP jest szczególnie przydatna do identyfikacji nieprawidłowości neutralnych pod względem kopii, takich jak inwersje i translokacje, które nie byłyby widoczne, patrząc na zmienność liczby kopii. Z biblioteki BAC oba końce wstawionych fragmentów są sekwencjonowane przy użyciu platformy sekwencjonowania. Wykrywanie odmian jest następnie osiągane przez mapowanie zsekwencjonowanych odczytów na genomie odniesienia.

Inwersja i translokacja

Inwersje i translokacje są stosunkowo łatwe do wykrycia przez nieprawidłową parę zsekwencjonowanych końców. Na przykład translokację można wykryć, jeśli sparowane końce są mapowane na różne chromosomy w genomie odniesienia. Inwersję można wykryć na podstawie rozbieżnej orientacji odczytów, gdzie wstawka będzie miała dwa końce dodatnie lub dwa końce ujemne.

Rearanżacje chromosomów wykryte przez ESP

Wstawianie i usuwanie

W przypadku insercji lub delecji mapowanie sparowanego końca jest zgodne z genomem odniesienia. Ale odczyty są niezgodne pod względem pozornej wielkości. Pozorny rozmiar to odległość zsekwencjonowanych końców BAC zmapowanych w genomie odniesienia. Jeśli BAC ma wstawkę o długości (l), zgodne mapowanie pokaże fragment o rozmiarze (l) w genomie odniesienia. Jeśli sparowane końce są bliżej niż odległość (l), podejrzewa się insercję w próbkowanym DNA. Odległość (l<μ-3σ) może być wykorzystana jako odcięcie do wykrycia wstawienia, gdzie μ jest średnią długością wkładki, a σ jest odchyleniem standardowym. W przypadku delecji sparowane końce są mapowane dalej w genomie odniesienia w porównaniu z oczekiwaną odległością (l> μ-3σ).

Kopiuj odmianę numeru

Kopiuj zmiany numerów wykryte przez ESP

W niektórych przypadkach niezgodne odczyty mogą również wskazywać na CNV , na przykład w powtórzeniach sekwencji. W przypadku większych CNV gęstość odczytów będzie się różnić w zależności od liczby kopii. Wzrost liczby kopii zostanie odzwierciedlony przez zwiększenie mapowania tego samego regionu w genomie odniesienia.

Historia ESP

ESP został po raz pierwszy opracowany i opublikowany w 2003 roku przez dr Collinsa i jego współpracowników z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco. Ich badanie ujawniło rearanżacje chromosomów i CNV ludzkich komórek nowotworowych MCF7 w rozdzielczości 150 kb, co jest znacznie dokładniejsze w porównaniu zarówno z CGH, jak i kariotypowaniem spektralnym w tamtym czasie. W 2007 roku dr Snyder i jego grupa poprawili rozdzielczość ESP do 3 kb poprzez sekwencjonowanie obu par fragmentów DNA o wielkości 3 kb bez konstrukcji BAC. Ich podejście jest w stanie zidentyfikować delecje, inwersje, insercje ze średnią rozdzielczością punktu przerwania 644 bp, która jest zbliżona do rozdzielczości reakcji łańcuchowej polimerazy ( PCR).

Aplikacje ESP

Do analizy profilowania sekwencji końcowej można wykorzystać różne narzędzia bioinformatyczne. Typowe to BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, common LAW, GASV i Spanner. ESP można wykorzystać do mapowania zmienności strukturalnej w wysokiej rozdzielczości w tkance chorej. Technikę tę stosuje się głównie w przypadku próbek guzów pochodzących z różnych typów nowotworów. Dokładna identyfikacja nieprawidłowości chromosomalnych neutralnych pod względem kopii jest szczególnie ważna, ponieważ translokacja może prowadzić do białek fuzyjnych, białek chimerycznych lub nieprawidłowo regulowanych białek, które można zaobserwować w nowotworach. Technikę tę można również wykorzystać w badaniach ewolucji, identyfikując duże zróżnicowanie strukturalne między różnymi populacjami. Podobne metody są opracowywane dla różnych zastosowań. Na przykład, do oceny różnorodności mikrobiologicznej przez sekwencjonowanie znacznika 16S V6 zastosowano metodę sekwencjonowania sparowanych końców Illumina (BIPES) z kodem kreskowym.

Zalety i ograniczenia

Rozdzielczość wykrywania zmian strukturalnych za pomocą ESP została zwiększona do poziomu zbliżonego do PCR i może być dodatkowo ulepszona poprzez selekcję fragmentów DNA o bardziej równomiernej wielkości. ESP można zastosować zarówno ze sztucznym chromosomem, jak i bez niego. Dzięki BAC cenne próbki mogą zostać uwiecznione i zakonserwowane, co jest szczególnie ważne w przypadku niewielkiej liczby małych próbek, które są planowane do szeroko zakrojonych analiz. Ponadto BAC niosące rearanżowane fragmenty DNA można bezpośrednio transfekować in vitro lub in vivo w celu analizy funkcji tych układów. Jednak budowa BAC jest nadal droga i pracochłonna. Badacze powinni bardzo uważać, aby wybrać strategię, której potrzebują do konkretnego projektu. Ponieważ ESP analizuje tylko krótkie sparowane sekwencje końcowe, ma tę zaletę, że dostarcza przydatnych informacji w całym genomie bez potrzeby sekwencjonowania na dużą skalę. Około 100-200 guzów można zsekwencjonować z rozdzielczością większą niż 150 kb w porównaniu z sekwencjonowaniem całego genomu.

Zobacz też