Resekcja końca DNA

Resekcja końca DNA , zwana także degradacją 5′–3′ , jest procesem biochemicznym, w którym tępy koniec odcinka dwuniciowego DNA (dsDNA) jest modyfikowany przez odcięcie niektórych nukleotydów od końca 5′ w celu wytworzenia pojedynczego 3′ - sekwencja okrężna. Obecność fragmentu jednoniciowego DNA (ssDNA) umożliwia dokładne ustawienie przerwanego końca DNA w pasującej sekwencji, dzięki czemu można go dokładnie naprawić.

Mechanizm regulacji resekcji 5' DSB mitotycznych i telomerowych.

Pęknięcia dwuniciowe (DSB) mogą wystąpić w dowolnej fazie cyklu komórkowego , powodując resekcję końca DNA i działania naprawcze, ale są one również normalnymi produktami pośrednimi w rekombinacji mitozy . Co więcej, naturalne końce liniowych chromosomów przypominają DSB i chociaż pęknięcia DNA mogą powodować uszkodzenie integralności genomowego DNA, naturalne końce są upakowane w złożone wyspecjalizowane pakiety ochronne DNA zwane telomerami, które uniemożliwiają naprawę DNA . Telomery i mitotyczne DSB mają różne funkcje, ale oba podlegają temu samemu procesowi degradacji 5′–3′.

Tło

Pęknięcie podwójnej nici to rodzaj uszkodzenia DNA, w którym obydwie nici w podwójnej helisie zostają zerwane. DSB występują tylko podczas replikacji DNA w cyklu komórkowym . Ponadto DSB mogą prowadzić do rearanżacji i niestabilności genomu. Przypadki, w których dwie komplementarne nici są połączone w punkcie DSB, mogą być katastrofalne, tak że komórka nie będzie w stanie ukończyć mitozy podczas następnego podziału i albo umrze, albo, w rzadkich przypadkach, ulegnie utracie chromosomów, duplikacjom , a nawet mutacje . Istnieją trzy mechanizmy naprawy DSB: łączenie końców niehomologicznych (NHEJ), łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) i rekombinacja homologiczna HR. Spośród nich tylko NHEJ nie polega na resekcji końca DNA.

Mechanizm

Dokładna naprawa DSB jest niezbędna do utrzymania integralności genomu. Spośród trzech istniejących mechanizmów naprawy DSB, dominującymi ścieżkami są mechanizmy naprawy NHEJ i HR. Kilka wysoce konserwatywnych białek uruchamia punkt kontrolny uszkodzenia DNA w celu wykrycia DSB po naprawie przez szlaki naprawy NHEJ lub HR. Mechanizm NHEJ działa w ligacji dwóch różnych DSB z wysoką wiernością, podczas gdy HR polega na homologicznym szablonie do naprawy końców DSB.

Resekcja końca DNA w ścieżce HR występuje tylko w dwóch określonych fazach: fazach S i G2 . Ponieważ szlak HR wymaga siostrzanych chromatyd do aktywacji, zdarzenie to zachodzi tylko w fazach G2 i S cyklu komórkowego podczas replikacji. DSB, które nie rozpoczęły resekcji końca DNA, mogą być ligowane przez szlak NHEJ, ale resekcja kilku nukleotydów hamuje szlak NHEJ i powoduje naprawę DNA przez szlak HR. Szlak NHEJ bierze udział w całym cyklu komórkowym, ale ma kluczowe znaczenie dla naprawy DNA podczas G1 . W fazie G1 nie ma siostrzanych chromatyd do naprawy DSB poprzez szlak HR, co czyni szlak NHEJ krytycznym mechanizmem naprawy.

Zanim nastąpi resekcja, pęknięcie musi zostać wykryte. U zwierząt wykrywanie to odbywa się za pomocą PARP1 ; podobne systemy istnieją u innych eukariontów : w roślinach PARP2 wydaje się odgrywać tę rolę. Wiązanie PARP następnie rekrutuje kompleks MRN do miejsca pęknięcia. Jest to wysoce konserwatywny kompleks składający się z Mre11 , Rad50 i NBS1 (znany jako Nibrin u ssaków lub Xrs2 u drożdży, gdzie ten kompleks nazywany jest kompleksem MRX ).

Zanim resekcja może się rozpocząć, białko oddziałujące z CtBP1 (CtIP) musi związać się z kompleksem MRN, aby mogła rozpocząć się pierwsza faza resekcji, a mianowicie resekcja końcowa krótkiego zasięgu. Po fosforylowanego CtIP podjednostka Mre11 jest zdolna do endonukleolitycznego przecięcia nici zakończonej 5' , prawdopodobnie około 300 par zasad od końca, a następnie działa jako egzonukleaza 3'→5' usuwając koniec nici 5' .

Resekcja telomerów DSB

Liniowe chromosomy są upakowane w złożone, wyspecjalizowane pakiety ochronne DNA zwane telomerami . Struktura telomerów jest wysoce konserwatywna i jest zorganizowana w wiele krótkich tandemowych powtórzeń DNA. Telomery i DSB mają różne funkcje, tak że telomery zapobiegają czynnościom naprawy DNA. Podczas telomerowej replikacji DNA w fazach S/G2 i G1 cyklu komórkowego, nić opóźniona 3' pozostawia krótki wystający fragment zwany ogonem G. Telomerowy DNA kończy się na końcu 3' G, ponieważ nić opóźniona 3' rozciąga się bez komplementarnej nici wiodącej 5' C. Ogon G zapewnia główną funkcję telomerowemu DNA, tak że ogony G kontrolują homeostazę telomerów.

Telomery w fazie G1

W fazie G1 cyklu komórkowego białka związane z telomerami RIF1 , RIF2 i RAP2 wiążą się z telomerowym DNA i uniemożliwiają dostęp do kompleksu MRX . Taki proces np. u S. Cerevisiae jest negatywnie regulowany przez to działanie. Kompleks MRX i kompleks Ku wiążą się jednocześnie i niezależnie z końcami DSB. W obecności białek związanych z telomerami, MRX nie wiąże się z końcami DSB, podczas gdy kompleks Ku wiąże się z końcami DSB. Związany kompleks Ku z końcami DSB chroni telomery przed degradacją nukleolityczną przez egzo1 . Powoduje to zahamowanie wydłużania telomerazy na końcach DSB i zapobiega dalszemu działaniu telomerów w fazie G1 cyklu komórkowego.

Telomery w późnej fazie S/G2

W późnej fazie S/G2 cyklu komórkowego, białka związane z telomerami RIF1, RIF2 i RAP2 wykazują działanie hamujące poprzez wiązanie się z telomerowym DNA. W późnej fazie S/G2 kinaza białkowa CDK1 (zależna od cyklin) sprzyja resekcji telomerów. Ta kontrola jest sprawowana przez kinazy zależne od cyklin , które fosforylują części mechanizmu resekcji. Proces ten łagodzi hamujący wpływ białek związanych z telomerami i umożliwia Cdc13 (białko wiążące zarówno na nici opóźnionej, jak i nici wiodącej) pokrycie telomerowego DNA. Wiązanie cdc13 z DNA hamuje punkt kontrolny uszkodzenia DNA i umożliwia resekcję, jednocześnie umożliwiając wydłużenie telomerazy na końcach DSB.

Resekcja mitotycznych DSB

Jedną z ważnych kontroli regulacyjnych w komórkach mitotycznych jest decyzja, którą konkretną ścieżkę naprawy DSB wybrać. Po wykryciu DSB, wysoce konserwatywne kompleksy są rekrutowane przez końce DNA. Jeśli komórka znajduje się w fazie G1 cyklu komórkowego, kompleks Ku zapobiega wystąpieniu resekcji i wyzwala czynniki szlaku NHEJ. DSB w szlaku NHEJ są ligowane, co jest etapem szlaku NHEJ, który wymaga ligazy DNA heterodimeru Dnl4-Lif1/XRCC4 i białka Nej1/XLF. Proces ten skutkuje podatną na błędy religacją końców DSB w fazie G1 cyklu komórkowego.

Jeśli komórki są w fazie S/G2, mitotyczne DSB są kontrolowane przez aktywność Cdk1 i obejmują fosforylację Sae2 Ser267. Po zajściu fosforylacji przez Cdk1, kompleks MRX wiąże się z końcami dsDNA i generuje krótki ssDNA, który rozciąga się w kierunku 5'. 5' ssDNA kontynuuje resekcję przez aktywność enzymu helikazy , enzymu Sgs1 i nukleaz Exo1 i Dna2. Zaangażowanie Sae2 Sar267 w przetwarzanie DSB jest wysoce konserwatywne u eukariontów, tak że Sae2 wraz z kompleksem MRX biorą udział w dwóch głównych funkcjach: wyżarzaniu pojedynczej nici i przetwarzaniu struktur DNA spinki do włosów. Podobnie jak wszystkie ssDNA w jądrze, wycięty region jest najpierw pokryty białka replikacyjnego A (RPA), ale RPA jest następnie zastępowany przez RAD51 , tworząc włókno nukleoproteinowe , które może brać udział w poszukiwaniu pasującego regionu, umożliwiając HR podjęcie miejsce. 3' ssDNA pokryty RPA sprzyja rekrutacji Mec1. Mec1 dodatkowo fosforyluje Sae2 wraz z cdk1. Wynikająca z tego fosforylacja przez Sae2 przez Mec1 pomaga zwiększyć efekt resekcji, a to z kolei prowadzi do aktywacji punktu kontrolnego uszkodzenia DNA.

Regulatory

Ścieżka z wyboru w naprawie DNA jest ściśle regulowana, aby zagwarantować, że komórki w fazie S/G2 i G1 wykorzystują odpowiedni mechanizm. Regulatory zarówno w ścieżce NHEJ, jak i HR pośredniczą w odpowiedniej ścieżce odpowiedzi naprawy DNA. Ponadto ostatnie badania nad naprawą DNA pokazują, że regulacja resekcji końca DNA jest regulowana przez aktywność cdk1 w cyklu replikacji komórki.

ścieżka NHEJ

Resekcja końca DNA jest kluczem do określenia prawidłowej ścieżki w NHEJ. Aby wystąpił szlak NHEJ, pozytywne regulatory, takie jak kompleks Ku i MRX, pośredniczą w rekrutacji innych białek związanych z NHEJ, takich jak Tel1, Lif1, Dnl4 i Nej1. Ponieważ NHEJ nie opiera się na końcowej resekcji, NHEJ może wystąpić tylko w fazie G1 cyklu komórkowego. Zarówno białka związane z Ku, jak i NHEJ zapobiegają rozpoczęciu resekcji.

Resekcja zapewnia, że DSB nie są naprawiane przez NHEJ (który łączy ze sobą uszkodzone końce DNA bez upewnienia się, że pasują), ale raczej metodami opartymi na homologii (dopasowywanie sekwencji DNA). Zależna od cyklin kinaza białkowa, taka jak cdk1 w drożdżach, służy jako negatywny regulator szlaku NHEJ. Każda aktywność związana z obecnością kinaz białkowych zależnych od cyklin hamuje szlak NHEJ

Pozytywne regulatory

Obecność ssDNA umożliwia dokładne ustawienie przerwanego końca DNA z pasującą sekwencją, dzięki czemu można go dokładnie naprawić. Aby szlak HR mógł wystąpić w fazach S i G2 cyklu komórkowego, wymagana jest dostępność chromatydy siostrzanej. Resekcja 5′–3′ automatycznie łączy DSB ze ścieżką HR. Zależna od cyklin kinaza białkowa, taka jak cdk1, służy jako pozytywny regulator szlaku HR. Ten pozytywny regulator sprzyja nukleolitycznej degradacji końców DNA 5′–3′. Wraz z cdk1, kompleks MRX, cyklina B1 i DSB indukowane Spo11 służą jako pozytywne regulatory szlaku HR.

Zobacz też