Rozpromieniony

BEAMing , co oznacza kulki, emulsję, amplifikację, magnetyczność, to bardzo czuła cyfrowa metoda PCR , która łączy emulsyjny PCR i cytometrię przepływową w celu identyfikacji i oceny ilościowej określonych mutacji somatycznych obecnych w DNA.

Proces

BEAMing rozpoczyna się od izolacji DNA z próbki krwi lub osocza pacjenta. Docelowe regiony oczyszczonego DNA przechodzą etap wstępnej amplifikacji za pomocą konwencjonalnego PCR z wykorzystaniem starterów o znanych sekwencjach w celu amplifikacji interesujących regionów genetycznych.

Amplifikowane matryce DNA są następnie wprowadzane do starterów, które są kowalencyjnie związane z kulkami magnetycznymi poprzez interakcje streptawidyna - biotyna i są dzielone na wodne mikrokrople emulsji woda-w-oleju . Faza wodna jest emulgowana z olejem, tworząc miliony pojedynczych kropelek wody o średnicy 3-10 mikronów. W obrębie każdej kropli przeprowadzana jest oddzielna reakcja PCR. Ze względu na niewielkie rozmiary każda kropla wody zawiera średnio pojedynczą cząsteczkę DNA i cząsteczkę magnetyczną. Oprócz wstępnie amplifikowanego DNA, każda kropla emulsji zawiera niezbędne odczynniki i kulki magnetyczne pokryte starterem ukierunkowanym na sekwencję do przeprowadzenia reakcji PCR w emulsji. Kropelki mikroemulsji poddaje się cyklom temperaturowym przy użyciu konwencjonalnych metod PCR. Każda matryca DNA (z kulką magnetyczną obecną w części wodnej) jest wydłużana i amplifikowana, w wyniku czego kulka jest pokryta tysiącami identycznych kopii fragmentu DNA matrycy.

polimerazę DNA o wysokiej wierności , aby ograniczyć błędy normalnie wprowadzane podczas PCR. Ten środek ostrożności ogranicza ryzyko fałszywie dodatniego wykrycia i umożliwia dokładne rozróżnienie cząsteczek docelowych.

Po etapie PCR w emulsji fazę wodną i olejową rozdziela się, aby mikrocząstki mogły zostać zebrane w fazie wodnej. Kropelki mikroemulsji są następnie rozbijane w celu uwolnienia kulek magnetycznych, do których przyłączone są zamplifikowane kopie DNA. Perełki są oczyszczane magnetycznie i dołączane są sondy fluorescencyjne specyficzne dla par zasad. Pomaga to rozróżnić fragmenty DNA typu dzikiego i zmutowanego, ponieważ jedna sonda fluorescencyjna wiąże się specyficznie z DNA typu dzikiego, a druga ze specyficznym zmutowanym DNA. Każda wyznakowana fluorescencyjnie kulka jest analizowana w cytometrze przepływowym, co skutkuje oddzieleniem zmutowanego DNA od typu dzikiego, jak również stosunkiem zmutowanego do dzikiego DNA obecnego w próbce.

Mikroskopijne kropelki emulsji stosowane w BEAMing pozwalają na podział segmentów DNA na pojedyncze kropelki. Emulsyjny PCR jest przeprowadzany na podzielonym na przedziały DNA, umożliwiając równoległe prowadzenie setek milionów reakcji PCR. Ta masowo równoległa platforma PCR zapewnia wysoki poziom czułości (0,001%) do wykrywania rzadkich cząsteczek DNA nowotworu wśród dużego tła DNA typu dzikiego.

Aplikacje

Metoda BEAMing jest często wykorzystywana w badaniach nad nowotworami do oceny krążącego DNA nowotworu ( ctDNA ), znanego również jako biopsja płynna . Pozwala również na ilościową ocenę zmutowanej frakcji próbki, którą można śledzić w czasie za pomocą seryjnych pomiarów osocza. Metoda ma próg czułości 0,01%.

Historia

Pod koniec lat 90. Vogelstein i Kinzler ukuli termin „ cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy ”, prowadząc badania nad mutacjami somatycznymi związanymi z rakiem jelita grubego i potencjalnie sprawczymi . Podstawowym wyzwaniem, dla którego zaprojektowano cyfrowy PCR, było wykrycie niewielkich ilości z góry określonej mutacji somatycznej w większych populacjach komórek. Podczas gdy zarówno cyfrowy, jak i klasyczny PCR można stosować w analizach ilościowych lub jakościowych, cyfrowy PCR analizuje próbki po jednej cząsteczce na raz, aby wytworzyć sygnał „wszystko albo nic”, zwiększając w ten sposób stosunek sygnału do szumu i ogólną czułość na rzadkie cele. Wyniki tych badań wykazały, że cyfrowa PCR była w stanie wiarygodnie określić ilościowo względną proporcję wariantów sekwencji w próbce DNA.

BEAMing wyrósł z cyfrowej technologii PCR iw 2003 roku został opisany w publikacji Nature Methods zespołu Vogelsteina. W 2005 roku zespół Vogelsteina opublikował swoje pierwsze dane kliniczne wykorzystujące technologię BEAMing do analizy próbek osocza pacjentów z rakiem. W Nature Medicine z 2008 r . pomiary BEAMing ctDNA były wystarczająco czułe, aby wiarygodnie monitorować dynamikę guza.

W 2008 roku powstała firma Inostics GmbH w celu komercjalizacji BEAMing. W 2014 roku firma Inostics została przejęta przez Sysmex Corporation , tworząc Sysmex Inostics.