Sekwencja rybozy
Ribose-seq to technika mapowania stosowana w badaniach genetycznych w celu określenia pełnego profilu osadzonych rybonukleotydów , w szczególności monofosforanów rybonukleozydów (rNMP), w genomowym DNA . Uważa się, że osadzone rybonukleotydy są najczęstszą zmianą DNA w komórkach, a ich obecność w genomowym DNA może wpływać na stabilność genomu. Ponieważ ostatnie badania sugerują, że rybonukleotydy w mysim DNA mogą wpływać na patologię choroby, włączenie rybonukleotydów do genomowego DNA stało się ważnym celem badań genetyki medycznej. Ribose-seq pozwala naukowcom określić dokładną lokalizację i typ rybonukleotydów, które zostały włączone do eukariotycznego lub prokariotycznego DNA.
Technika ta wykorzystuje obecność dodatkowych grup hydroksylowych (OH) znajdujących się na końcu 2' rybonukleotydów, które mogą zniekształcać i destabilizować DNA. Technika została opracowana we współpracy z grupą naukowców z Georgia Institute of Technology, w tym Francescą Storici i Kyung Duk Koh (obecnie na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco) oraz Jayem Hesselberthem z University of Colorado Anschutz Medical School.
Historia
Kwasy nukleinowe to podstawowe makrocząsteczki , które przenoszą informację genetyczną we wszystkich formach życia. Te biopolimery składają się z nukleotydowych , które są cząsteczkami organicznymi składającymi się z grupy fosforanowej , zasady zawierającej azot i pięciowęglowego cukru ( rybozy w rybonukleotydach i dezoksyrybozy w dezoksyrybonukleotydach ). Podczas gdy rybonukleotydy są zwykle zlokalizowane w kwasie rybonukleinowym ( RNA ), można je również znaleźć w kwasie dezoksyrybonukleinowym ( DNA ).
Pierwsze odkrycie monofosforanów rybonukleozydów (rNMP) osadzonych w DNA miało miejsce w mitochondrialnym DNA z komórek mysich i ludzkich w 1973 roku przez Lawrence'a Grossmana, Roberta Watsona i Jerome'a Vinograda. W 2006 r. Potwierdzono obecność rNMP w jądrowym DNA Schizosaccharomyces pombe („drożdże rozszczepialne”) i od tego czasu trwają badania innych gatunków.
Włączanie rybonukleotydów do DNA
W wielu badaniach zidentyfikowano mechanizmy, dzięki którym rybonukleotydy mogą być dodawane, usuwane lub generowane z DNA. Przede wszystkim rybonukleotydy są włączane do DNA podczas procesu syntezy DNA. Aby zainicjować replikację DNA , krótkie startery RNA są syntetyzowane na komplementarnym DNA, aby umożliwić późniejsze wiązanie i działanie replikacyjne głównych enzymów replikacyjnych, polimeraz DNA . Zazwyczaj te startery są następnie usuwane przez enzymy nukleazy, RNazy H lub endonukleaza specyficzna dla struktury klapki 1 (FEN1). W związku z tym istnieje dość znaczna ilość przejściowych rNMP, które są obecne w DNA w postaci starterów RNA, a następnie są usuwane. Po zainicjowaniu replikacji DNA, rNMP mogą być w pełni włączone do DNA przez polimerazy DNA i stanowi to główny mechanizm włączania rybonukleotydów do DNA z ponad 1 rybonukleotydem na 1000 włączonych dezoksyrybonukleotydów. Wbudowane rNMP są często celem usunięcia przez mechanizm naprawy wycięcia rybonukleotydów (RER). Jeśli jednak RER nie działa prawidłowo, może to stać się bardziej trwałym źródłem osadzonych rNMP w DNA. Innym mechanizmem powstawania rNMP w DNA jest stres oksydacyjny, który zmienia jednostkę dezoksyrybozy w DNA na rybozę. Podczas gdy szlak RER jest najskuteczniejszym procesem usuwania rNMP z DNA, rybonukleotydy można również usuwać poprzez aktywność egzonukleazy 3'-5', która jest kierowana przez czynności sprawdzające polimerazy DNA podczas replikacji DNA. Dodatkowe metody usuwania rNMP obejmują nacięcia, w których pośredniczy enzym izomerazy, topoizomeraza I.
Konsekwencje rybonukleotydów w DNA
Jeśli nie zostaną usunięte i zastąpione, rybonukleotydy w DNA mogą mieć strukturalny, chemiczny i funkcjonalny wpływ na procesy komórkowe. Jak po raz pierwszy rozpoznali TN Jasihree i wsp. w 1993 r., obecność rybonukleotydów może zmienić helikalny kształt DNA z formy B na formę A. . To, oprócz wielu innych konsekwencji chemicznych, może wpływać na wiązanie białek z DNA i mieć wpływ na procesy, takie jak dynamika chromatyny, replikacja DNA, transkrypcja, naprawa i mejoza. Ponadto niektóre polimerazy DNA nie są w stanie ominąć osadzonych rNMP podczas replikacji DNA, co dodatkowo pogarsza się w miejscach z dłuższymi niciami rNMP. Może to powodować stres replikacyjny, który może potencjalnie zakłócać transkrypcję, segregację chromosomów i przyszłą replikację. Co więcej, niektóre produkty uboczne lub błędy w procesie RER mogą również potencjalnie prowadzić do pęknięć DNA, rearanżacji i niestabilność genomu .
Mapowanie rybonukleotydów
Do 2015 roku niektóre mechanizmy, konsekwencje i przybliżone wskaźniki włączania rNMP do DNA stawały się coraz bardziej jasne. Jednak nadal brakowało techniki identyfikacji lokalizacji rNMP w całym genomie. Rosnąca dostępność technologii sekwencjonowania nowej generacji w dużej mierze ułatwiła postęp w kierunku dokładniejszej identyfikacji rNMP w genomowym DNA. W 2015 roku Kyung Duk Koh, Sathya Balachander, Jay R Hesselberth i Francesca Storici przedstawili rybose-seq, nowo opracowaną technikę systematycznego profilowania rNMP w DNA. Zastosowali sekwencję rybozy do Saccharomyces cerevisiae genom w celu udokumentowania tożsamości, częstotliwości i lokalizacji rNMP w całym genomie w mitochondrialnym i jądrowym DNA . Odkrycia te ostatecznie dostarczyły nowych informacji na temat wzorców inkorporacji rNMP w całym genomie. Równolegle z rybozą-seq opracowano trzy inne techniki wychwytywania miejsc rNMP osadzonych w DNA: emRibo-seq, HydEn-seq i Pu-seq. Procedura rybozy-seq wykorzystuje szereg unikalnych cech do wychwytywania i znakowania rybonukleotydów w ramach przygotowań do wysokowydajnego sekwencjonowania. Aby bezpośrednio celować w miejsca rNMP, autorzy wykorzystali proces obróbki alkaliami, który denaturuje i rozszczepia DNA w miejscach rNMP. Specyficzność rozszczepienia w tych miejscach jest spowodowana względną czułością cząsteczki w tym regionie z powodu dodatkowej grupy hydroksylowej obecnej na rybonukleotydach. Aby umożliwić stabilność i wzbogacenie tych małych fragmentów oraz ochronę przed trawieniem egzonukleazą T5 przed amplifikacją PCR, jednoniciowe fragmenty DNA - zawierające interesujący rNMP i unikalny molekularny numer identyfikacyjny - są samoligowane, tworząc jednoniciowy DNA (ssDNA ) kręgi. W celu ułatwienia ligacji końca rNMP i DNA, Koh i in. wykorzystać charakterystyczne działanie ligacyjne ligazy tRNA Arabidopsis thaliana (AtRNL), aby umożliwić wiązanie 2'-fosforanu (strona rNMP) z 5'-fosforanem (strona DNA). Wreszcie, wysokoprzepustowe sekwencjonowanie całej wygenerowanej biblioteki z tej techniki identyfikuje współrzędne genomowe wszystkich przechwyconych osadzonych rNMP. W 2019 r. laboratorium Storici przedstawiło zaktualizowany i dalej zoptymalizowany protokół dla rybozy-seq. Modyfikacje obejmowały zastosowanie krótszych adapterów molekularnych kodów kreskowych, mniejszych fragmentów, zmienionych ustawień PCR i dostosowanych zakresów wielkości do cięcia i oczyszczania z żelu. Ogólnie zasugerowano, że ulepszony protokół może znacznie zwiększyć skuteczność metody w zastosowaniach do dużych genomów.
Metody
Przygotowanie
Ekstrakcja genomowego DNA
Aby wyodrębnić genomowy DNA z komórek będących przedmiotem zainteresowania, komórki muszą najpierw zostać poddane lizie metodami mechanicznymi lub chemicznymi. To uwalnia DNA z jądra każdej komórki, umożliwiając jego oczyszczenie i oznaczenie ilościowe. W protokole ryboza-seq wymagane jest w sumie 10 µG DNA.
Przygotowanie adaptera ryboza-seq
Adapter ryboza-sekwencja składa się z jednego dT (tymina dezoksyrybonukleotydu), po którym następuje sekwencja hybrydyzacji, dwie sekwencje starterów i unikalny identyfikator molekularny (UMI). W celu przygotowania adaptera ryboza-seq, trzy oligonukleotydy (oligo) dodaje się do roztworu i ogrzewa do 95-100°C. W tej temperaturze sekwencje oligo łączą się ze sobą, tworząc zawiesinę adapterów ryboza-seq. Następnie określa się ilościowo odsoloną dwuniciową rybozę-sekw. Dla rybozy-sekw. potrzebne jest stężenie 10 uM.
Rybozy-Seq
Fragmentacja genomowego DNA
Genomowy DNA jest fragmentowany przy użyciu trawienia enzymami restrykcyjnymi na tępo zakończonych końcach . Po trawieniu pofragmentowany DNA jest oczyszczany i oznaczany ilościowo. Zestaw enzymów restrykcyjnych i narzędzia do optymalizacji kombinacji dla technik wychwytywania rNMP (RESCOT) zostały opracowane w celu maksymalizacji szybkości wychwytywania rNMP. Otrzymany roztwór zawiera populację fragmentów genomowych o wielkości od 500 do 3000 pz o średniej wielkości około 1,5 kb. 10 ug pofragmentowanego genomowego DNA jest wymagane do późniejszego ogonowania dA i ligacji adaptera.
dA-Tailing i ligacja adaptera
Cząsteczki dA są związane z ogonami każdego fragmentu, umożliwiając dT adaptera seq rybozy związanie odpowiadającego mu ogona dA w kolejnym etapie. Po tym procesie DNA z ogonem dA jest oczyszczane i eluowane wodą. Adapter ryboza-seq, zawierający jego losowy unikalny identyfikator molekularny (UMI) o długości 8 zasad i pojedynczy wystający fragment dT, jest następnie ligowany z końcem dA docelowego fragmentu przez schłodzenie roztworu do 15°C przez noc. Próbka jest następnie oczyszczana i przygotowywana do obróbki alkalicznej.
Leczenie alkaliczne
Podczas traktowania alkaliami dwuniciowy DNA (dsDNA) jest traktowany wodorotlenkiem sodu, mocną zasadą, w celu denaturacji dsDNA i rozszczepienia DNA w osadzonych miejscach rybonukleotydowych. To generuje jednoniciowe fragmenty DNA (ssDNA) z odsłoniętymi dwoma końcami: jednym 2',3'-cyklicznym końcem fosforanowym i przeciwległym końcem 5'-hydroksylowym. Roztwór alkaliczny jest następnie neutralizowany, a ssDNA jest oczyszczane.
Samoligacja (krążenie)
Następnie roztwór zawierający ssDNA inkubuje się z ligazą tRNA Arabidopsis thaliana (AtRNL24). AtRNL pomaga w dojrzewaniu rRNA A. thalinana, przekształcając 2',3'-cykliczne fosforanowe końce RNA w 2'-fosforanowe i liguje je z 5'-fosforanowymi końcami RNA lub DNA. Wprowadzenie AtRNL do roztworu ssDNA katalizuje samoligację ssDNA, gdy 2',3' cykliczne końce fosforanowe łączą się z końcem fosforanowym 5' tej samej nici ssDNA. Powstałe cykliczne struktury ssDNA zawierają ukierunkowaną osadzoną sekwencję rybonukleotydową, UMI i sekwencje oligo, które tworzą resztę kolistej struktury ssDNA.
Usunięcie liniowego ssDNA
Okrągłe struktury ssDNA utworzone przez samoligację są odporne na degradację przez enzym egzonukleazę T5. Jednak nieligowany, liniowy ssDNA nie jest. Dlatego traktowanie produktów i pozostałych fragmentów DNA egzonukleazą T5 selektywnie degraduje nieligowane, liniowe nici ssDNA, pozostawiając nienaruszone samoligowane kręgi ssDNA. W ten sposób niepożądane liniowe fragmenty ssDNA ulegają degradacji i pozostają tylko pomyślnie zligowane kręgi ssDNA.
Usuwanie 2'fosforanu
Zanim reakcja PCR będzie możliwa, należy usunąć grupy fosforanowe 2' na zligowanych połączeniach kręgów ssDNA. W tym celu kolisty roztwór ssDNA traktuje się 2'fosfotransferazą, Tpt1, usuwając fosforan 2' pozostały na złączu ligacyjnym.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
Po sekwencjonowaniu rybozy przeprowadza się amplifikację na każdym okręgu ssDNA stosując amplifikację PCR. W pierwszej rundzie PCR do roztworu wprowadza się startery do sekwencjonowania i powiela się kręgi ssDNA. Wybrane startery do sekwencjonowania muszą być zgodne z wybraną biblioteką docelową. zobacz sekcję Aplikacje . W drugiej rundzie PCR wprowadza się bardziej specyficzne startery do sekwencjonowania, a kółka ssDNA są dalej amplifikowane. Przeprowadza się elektroforezę w żelu poliakryloamidowym (PAGE) w celu potwierdzenia obecności biblioteki seq rybozy oraz w celu sprawdzenia kontroli dodatnich i ujemnych.
Dobór rozmiaru i oczyszczanie żelu
Oczyszczanie na żelu stosuje się do oczyszczania biblioteki seq-rybozy przed sekwencjonowaniem. Na tym etapie fragmenty są wybierane według długości w celu wyeliminowania fragmentów, które nie mieszczą się w docelowym zakresie wielkości będących przedmiotem zainteresowania.
Użyj do dalszych zastosowań
Po wychwyceniu i oczyszczeniu sekwencji będących przedmiotem zainteresowania próbki można zsekwencjonować i wykorzystać do dalszych zastosowań. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz sekcję Aplikacje .
Aplikacje
Ribose-seq można zastosować w wielu okolicznościach i dla wielu typów komórek różnych gatunków eukariotycznych (patrz: Zalety i ograniczenia ).
Wstępna charakterystyka
Ribose-seq został po raz pierwszy wykorzystany przez Koh et al. (2015) w celu scharakteryzowania lokalizacji rNMP w mitochondrialnym i jądrowym DNA pączkujących drożdży z niedoborem RNazy-H2 ( rnh201∆ ). Odkryli, że rNMP były obecne w ilości 0,449 rNMP na kilozasady (kb) w genomie jądrowym i 19,5 rNMP na kb w genomie mitochondrialnym. Ponadto Koh i in . (2015) byli w stanie zidentyfikować pozorną stronniczość, która istnieje przy włączaniu rC i rG do DNA. Odkryli, że w komórkach drożdży rC i rG są zatrzymywane w genomowym DNA z wyższymi częstotliwościami niż rAs i rUs, w stosunku do odpowiednich oczekiwanych częstotliwości wszystkich zasad. Niezależnie od typu podstawowego, rNMP były często obecne w miejscach, które znajdowały się bezpośrednio za dA zarówno w jądrowym, jak i mitochondrialnym DNA. Zidentyfikowano również wiele dodatkowych „hotspotów” do włączania rNMP w odniesieniu do specyficznych cech genomowych (np. w określonych miejscach genów, niciach lub regionach chromosomalnych).
Porównania wielogatunkowe
Rozwijając wstępną charakterystykę, Balachander i in. (2020) zoptymalizowali swój protokół rybozy-seq i wykorzystali go w połączeniu z narzędziem bioinformatycznym (Ribose-Map, dostępnym pod adresem https://github.com/agombolay/ribose-map ) do mapowania rNMP w mitochondrialnym i jądrowym DNA wielu szczepy trzech gatunków drożdży: Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces paradoxus i Schizosaccharomyces pombe . W mitochondrialnym DNA (mtDNA) każdego z tych gatunków i szczepów wykazano, że na typ rNMP, który jest włączony do danej pozycji genomowej, największy wpływ ma dNMP, który znajduje się w bezpośredniej pozycji powyżej (-1). Używając rybozy-seq w wielu genomach, Balachander i in. byli również w stanie wyjaśnić różne podobieństwa i różnice między szczepami i gatunkami drożdży. Wzory rNMP w mtDNA wszystkich szczepów wykazywały niskie częstotliwości rUs; jednak S. paradoxus i S. cerevisiae wskazują na preferencje dla rC, podczas gdy S. pombe wskazane preferencje dla rG. W DNA jądrowym trzy gatunki drożdży były w dużej mierze podobne. Dodatkowo rNMP zostały znacznie wzbogacone w krótkie sekwencje powtórzeń nukleotydów. To zastosowanie rybozy-seq umożliwiło scharakteryzowanie wzorców włączania rNMP i identyfikację potencjalnych czynników napędzających ten proces w kontekście sekwencji.
Poza genomem drożdży
W pierwszym badaniu mapowania rybonukleotydów, które miało zostać przeprowadzone na gatunkach innych niż drożdże, rybose-seq zastosowano w połączeniu z Ribose-Map do mapowania rNMP w całym genomie jądrowym, mitochondrialnym i chloroplastowym Chlamydomonas reinhardtii, fotosyntetycznej jednokomórkowej zielonej algi . W mitochondrialnym i chloroplastowym DNA tego gatunku rAs wydawał się być preferencyjnie włączany w stosunku do innych zasad, podczas gdy jądrowy DNA wykazywał tendencję do włączania rG i rC. We wszystkich C. reinhardtii organelli, rU był konsekwentnie najmniej reprezentowany rNMP, co jest zgodne z ustaleniami z mitochondriów drożdży. Podobnie jak w przypadku profili drożdży, na włączenie rNMP do C. reinhardtii największy wpływ ma dNMP bezpośrednio w górę (pozycja -1). W tym ustawieniu zastosowanie Ribose-seq pozwoliło po raz pierwszy zidentyfikować rozkłady i wzorce inkorporacji rNMP u tego gatunku.
Zalety i ograniczenia
Zalety rybozy-sekw
Ponieważ sekwencja rybozy specyficznie celuje w rybonukleotydy osadzone w DNA i nie wychwytuje starterów RNA ani fragmentów Okazaki, jest wysoce przenośna i może skutecznie celować w osadzone rybonukleotydy w szerokiej gamie genomowego DNA. Dlatego ryboza-seq pozwala na mapowanie rNMP w różnych typach genomów, w tym małych cząsteczkach genomowych lub dużych genomach jądrowych, bez konieczności stosowania standardowych procedur. Dodatkowo specyficzność rybozy-seq pozwala na mapowanie rNMP nawet w warunkach, w których DNA jest wystawiony na działanie stresorów środowiskowych, które uszkadzają DNA poprzez generowanie pęknięć i/lub miejsc pozbawionych zasad.
Ribose-seq wykorzystuje UMI w adapterach do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, co pozwala na wykonanie deduplikacji odczytów sekwencjonowania, a tym samym zapewnia dokładniejsze wykrywanie hotspotów rNMP.
Sekwencja rybozy nie jest specyficzna dla komórek drożdży; technika ta mogłaby potencjalnie zostać zastosowana do dowolnego typu komórek dowolnego gatunku, co czyni ją użytecznym narzędziem do wyjaśnienia lokalizacji i wzorca rNMP w większości organizmów.
Ribose-seq wykorzystuje powszechny sprzęt laboratoryjny i odczynniki, które są dość łatwe do pozyskania, co czyni go dostępną techniką do stosowania w wielu laboratoriach biologii molekularnej.
Ograniczenia sekw. rybozy
Ponieważ celuje w pojedyncze rNMP, sekwencja rybozy nie może wychwytywać dłuższych odcinków rybonukleotydów. Dlatego sekwencja rybozy nie byłaby odpowiednią techniką do mapowania starterów RNA lub fragmentów Okazaki, które mogą powstawać podczas replikacji lub pęknięć DNA.
Ribose-seq zajmuje około 4 dni, aby przygotować biblioteki rNMP z genomowego DNA. Protokół jest również stosunkowo złożony i wymaga wielu kroków.
Metody uzupełniające
Mapa Rybozy
Ribose-Map to narzędzie bioinformatyczne do przetwarzania i analizy dużych, złożonych zestawów surowych danych sekwencjonowania rNMP. Ribose-Map jest kompatybilna z rybose-seq, emRiboSeq, Pu-seq, Alk-HydEn-seq i RHII-HydEn-seq. (patrz: Inne techniki przechwytywania rNMP ).
RESCOT (zestaw enzymów restrykcyjnych i narzędzia do optymalizacji kombinacji)
RESCOT to metoda obliczeniowa, która oblicza pokrycie genomowe regionów wychwytywanych przez RNMP dla danego wyboru enzymów restrykcyjnych, a następnie optymalizuje zestawy RE i wybiera zestaw RE z najwyższym pokryciem, aby zmaksymalizować szybkość wychwytywania rNMP.
Inne techniki przechwytywania rNMP
- emRiboSeq : Wykorzystuje ludzką RNazę H2 i ligazę T4 Quick do wychwytywania dezoksyrybonukleotydu przed osadzonym rNMP od strony 5'.
- RHII-HyEn-seq : Wykorzystuje ligazę RNazy HII i T4 RNA Escherichia coli do wychwytywania wbudowanego rNMP z jego strony 5'. RHII-HydEn-seq może również wychwytywać sekwencję DNA zakończoną rNMP i fragmenty Okazaki.
- Pu-seq : wykorzystuje warunki alkaliczne i ligazę RNA T4 do wychwytywania dezoksyrybonukleotydu poniżej osadzonego rNMP od strony 3 '. Może chwytać fragmenty Okazaki.
- Alk-HydEn-seq : wykorzystuje warunki alkaliczne i ligazę RNA T4 do wychwytywania dezoksyrybonukleotydu poniżej osadzonego rNMP od strony 3 '. Może również przechwytywać fragmenty Okazaki.
- RiSQ-seq (sekwencjonowanie ilościowe ze skanowaniem rybonukleotydów) : Wykorzystuje bezwzględne oznaczanie ilościowe do wychwytywania sąsiedniego dezoksyrybonukleotydu rNMP.