Skanowanie alaninowe
W biologii molekularnej skanowanie alaniną jest techniką ukierunkowanej mutagenezy stosowaną do określenia udziału określonej reszty w stabilności lub funkcji danego białka. Alanina jest stosowana ze względu na jej nieporęczną, chemicznie obojętną metylową grupę funkcyjną, która mimo to naśladuje preferencje struktury drugorzędowej , które posiada wiele innych aminokwasów. Czasami duże aminokwasy, takie jak walina lub leucyna, są używane w przypadkach, gdy konieczne jest zachowanie wielkości zmutowanych reszt.
Technikę tę można również zastosować do określenia, czy łańcuch boczny określonej reszty odgrywa znaczącą rolę w bioaktywności . Zwykle osiąga się to poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce lub losowo, tworząc bibliotekę PCR . Ponadto opracowano metody obliczeniowe do szacowania parametrów termodynamicznych na podstawie teoretycznych podstawień alaninowych.
Technika ta jest szybka, ponieważ jednocześnie analizuje się wiele łańcuchów bocznych, co pozwala uniknąć konieczności oczyszczania białek i analizy biofizycznej. Technologia jest w tym momencie bardzo dojrzała i jest szeroko stosowana w dziedzinach biochemii. Dane można testować za pomocą IR , NMR , metod matematycznych, testów biologicznych itp.
Dobrym przykładem skanowania alaninowego jest badanie roli naładowanych reszt na powierzchni białek. W systematycznym badaniu roli konserwatywnych reszt naładowanych na powierzchni nabłonkowego kanału sodowego ( ENaC ) zastosowano skanowanie alaninowe w celu ujawnienia znaczenia reszt naładowanych w procesie transportu białek na powierzchnię komórki.
Aplikacje
Skanowanie alaniną zastosowano do jednoczesnego określenia funkcjonalnego wkładu 19 łańcuchów bocznych zakopanych na granicy między ludzkim hormonem wzrostu a domeną zewnątrzkomórkową jego receptora. Każdy aminokwas w łańcuchach bocznych został zastąpiony alaniną. wykorzystano metodę skanowania shotgun, która łączy koncepcje mutagenezy skanowania alaniną i mutagenezy dwumianowej z technologią prezentacji fagowej.
Innym krytycznym zastosowaniem skanowania alaninowego jest określenie wpływu poszczególnych reszt na strukturę i aktywność prototypowego cyklotydu kalata B1. Cyklotydy wykazują szeroki zakres farmaceutycznie ważnych bioaktywności, ale ich naturalną funkcją jest obrona roślin jako środki owadobójcze. W strukturze cyclotides kalata B1 wszystkie 23 reszty niecysteinowe zostały kolejno zastąpione alaniną. Dane zbadano metodą spektroskopii NMR .
Ponadto skanowanie alaniną jest również wykorzystywane do określenia, który motyw funkcjonalny Cry4Aa ma działanie komarabójcze. Cry4Aa został wyprodukowany przez Bacillus thuringiensis . Jest to toksyna specyficzna dla muchówek i odgrywa ważną rolę w produkcji bioinsektycydu do zwalczania komarów. Dlatego bardzo ważne jest ustalenie, który motyw funkcjonalny Cry4Aa przyczynia się do tej aktywności. W tym badaniu wykonano kilka mutantów Cry4Aa, zastępując reszty potencjalnego miejsca wiązania receptora, pętle 1, 2 i 3 w domenie II alaniną. W celu zbadania aktywności zastosowano test biologiczny Culex pipiens .
Model Alanina-Świat
Metoda skanowania alaninowego wykorzystuje fakt, że większość aminokwasów kanonicznych można wymienić na Ala przez mutacje punktowe, podczas gdy drugorzędowa struktura zmutowanego białka pozostaje nienaruszona, ponieważ Ala naśladuje preferencje struktury drugorzędowej większości kodowanych lub kanonicznych aminokwasów . Przewiduje to model Alanine-World .
Dalsza lektura
- Michels CA (2002). Techniki genetyczne w badaniach biologicznych: podejście studium przypadku . Londyn: J. Wiley. P. 111. ISBN 978-0-471-89921-1 .