Specyfikacja ektodermy
W Xenopus laevis specyfikacja trzech listków zarodkowych ( endodermy , mezodermy i ektodermy ) występuje na etapie blastuli . Dołożono wszelkich starań, aby określić czynniki określające endodermę i mezodermę. w ostatniej dekadzie opisano tylko kilka przykładów genów wymaganych do specyfikacji ektodermy . Pierwszą zidentyfikowaną cząsteczką wymaganą do specyfikacji ektodermy była ligaza ubikwityny Ectodermin (Ecto, TIF1-γ, TRIM33); później stwierdzono, że enzym deubikwitynujący, FAM/USP9x , jest w stanie przezwyciężyć efekty ubikwitynacji wywołane przez Ectodermin w Smad4 (Dupont i in., 2009). Zaproponowano dwa czynniki transkrypcyjne do kontrolowania ekspresji genów specyficznych genów ektodermalnych: POU91/Oct3/4 i FoxIe1/Xema . Wykazano , że nowy czynnik specyficzny dla ektodermy, XFDL156 , jest niezbędny do hamowania różnicowania mezodermy z komórek pluripotencjalnych.
Ektodermina i FAM
Biologiczna rola ektoderminy i FAM
Białko ektodermina, po raz pierwszy zidentyfikowane w zarodkach Xenopus , promuje los ektodermy i hamuje tworzenie mezodermy, w której pośredniczy sygnalizacja transformującego czynnika wzrostu β (TGFβ) i białek morfogenetycznych kości (BMP), członków nadrodziny TGFβ. Kiedy ligandy TGFβ wiążą się z receptorami TGFβ, powodują aktywację przekaźników sygnału R-Smads ( Smad2 , Smad3 ). Smad4 tworzy kompleks z aktywowanymi R-Smads i aktywuje transkrypcję określonych genów w odpowiedzi na sygnał TGFβ. Ścieżka BMP przesyła swoje sygnały w podobny sposób, ale przez inne typy R-Smads ( Smad1 , Smad5 i Smad8). Czynnik transkrypcyjny Smad4 jest jedynym wspólnym mediatorem wspólnym dla szlaków TGFβ i BMP. Podczas specyfikacji ektodermy funkcja Smad4 jest regulowana przez ubikwitynację i deubikwitynację odpowiednio przez ektoderminę i FAM. Stan ubikwitynacji Smad4 określi, czy jest on w stanie odpowiedzieć na sygnały pochodzące z TGFβ i BMP. Równowaga aktywności, lokalizacji i synchronizacji przetworników TGFβ i BMP, Smad4, FAM i Ectodermin powinna zostać osiągnięta, aby móc modulować ekspresję genów wymaganych do tworzenia listka zarodkowego.
Identyfikacja ektoderminy i FAM
Bibliotekę cDNA z stadium blastuli zarodka żaby wklonowano do plazmidów ekspresyjnych RNA w celu wytworzenia syntetycznego mRNA. Następnie mRNA wstrzyknięto kilku Xenopus w stadium czterokomórkowym i obserwowano we wczesnych zarodkach blastuli ekspansję regionu ektodermalnego markera Sox2 i zmniejszenie ekspresji mezodermalnego markera Xbra . Ektodermina była jednym z 50 klonów prezentujących ten fenotyp po wstrzyknięciu do zarodków. Identyfikację FAM przeprowadzono za pomocą siRNA w celu znalezienia deubikwitynaz , które regulują odpowiedź na TGFβ.
Lokalizacja ektoderminy i FAM
MRNA ektoderminy jest odkładany przez matkę w zwierzęcym biegunie jaja. We wczesnym stadium blastuli zarodka mRNA i białko ektoderminy tworzą gradient, który przechodzi od bieguna zwierzęcego (najwyższe stężenie) do strefy brzeżnej (najniższe stężenie), aby zapobiec TGFβ i sygnałom węzłowym, które indukują mezodermę pochodzącą z bieguna roślinnego . MRNA ektoderminy jest wzbogacane w grzbietowej stronie zarodka, a pod koniec tego etapu ekspresja stopniowo zanika. Smad4 jest ubikwitynowany przez ektoderminę w jądrze i eksportowany do cytoplazmy, gdzie może zostać zdeubikwitynowany przez FAM; w ten sposób Smad4 może zostać poddany recyklingowi i znów będzie działał. Chociaż nie ma profilu ekspresji FAM we wczesnych zarodkach Xenopus , u danio pręgowanego homolog FAM jest wyrażany wszechobecnie na etapie dwóch komórek, ale w miarę postępu rozwoju ulega ekspresji tylko w ośrodkowym układzie nerwowym głowy.
Funkcje ektoderminy i FAM
Ektodermina jest ligazą E3 ubikwityny, która hamuje szlaki sygnałowe TGFβ i BMP poprzez hamowanie Smad4 poprzez ubikwitynację lizyny 519, a także poprzez bezpośrednie wiązanie z fosfo-Smad2. Wstrzyknięcie Ecto mRNA w strefę brzeżną prowadzi do ekspansji wczesnego markera ektodermalnego Sox2 i redukcji markerów mezodermalnych (Xbra, Eomes, Vent-1, Mix-1 i Mixer). Odwrotnie dzieje się w eksperymentach z powaleniem Ectoderminy przy użyciu strategii morfolino; zarodki stają się bardziej wrażliwe na odpowiedź aktywiny, wykazują wzrost i ekspansję ekspresji genów specyficznych dla mezodermy i zmniejszają ekspresję płytki nerwowej i markera naskórka (odpowiednio Sox2 i cytokeratyna). Zgodnie z aktywnością ligazy ubikwitynowej zależnej od palca RING Ectoderminy, mutant Ecto RING-finger (C97A / C100A) jest nieaktywny we wzmocnieniu funkcji. Wzmocnienie funkcji FAM zwiększa odpowiedzi z BMP i TGFβ, a utrata funkcji przez mutację w reszcie krytycznej dla jego aktywności spowodowała zahamowanie odpowiedzi TGFβ.
Ochrona ektoderminy i FAM u innych gatunków
Funkcja molekularna ludzkiej ektoderminy działająca jako negatywny regulator Smad4 sugeruje, że ta specyficzna funkcja jest zachowana wśród linii kręgowców. Identyczność sekwencji między homologami FAM jest wyższa niż 90% przy porównaniu homologów Xenopus , danio pręgowanego, myszy i człowieka, co sugeruje, że może to być również zachowane wśród innych organizmów. Rzeczywiście, inaktywacja genu nokautu w zarodkach myszy wykazała, że funkcja ektoderminy jako inhibitora sygnalizacji TGF-beta jest zachowana. Zarodki pozbawione ektoderminy wykazują wadliwy rozwój przedniej endodermy trzewnej (AVE), która jest pierwszą tkanką indukowaną przez sygnały TGF-beta w embrionach myszy; zgodnie z utratą inhibitora, zarodki ektoderminy-/- wykazywały powiększoną indukcję AVE. Ponieważ AVE jest naturalnym źródłem wydzielanych antagonistów TGF-beta, ta pierwotna ekspansja AVE powodowała wtórnie, na późniejszych etapach, hamowanie pozakomórkowych ligandów TGF-beta, co skutkowało brakiem rozwoju mezodermy zarodków. Model ten został potwierdzony przez odkrycie, że zarodki ektoderminy-/- zostały uratowane do typu dzikiego (normalny AVE, normalny rozwój mezodermy) przez obniżenie dawki genetycznej głównego ligandu TGF-beta zarodka, Nodal. Dalsze wspieranie roli inhibitora TGF-beta, selektywna tkankowo delecja ektoderminy z epiblastu (z którego pochodzi mezoderma, ale nie AVE) pozostawiła AVE nietkniętą, ale tym razem spowodowała ekspansję przednich mezodermalnych losów, co wskazuje na zwiększoną reaktywność na sygnały TGF-beta. Łącznie dane te potwierdziły za pomocą narzędzi genetycznych niezależną od komórki rolę ektoderminy jako inhibitora odpowiedzi Smad4 zidentyfikowanych wcześniej w zarodkach Xenopus i ludzkich liniach komórkowych.
FOXI1e
Biologiczna rola FOXI1e
Podczas wczesnej fazy rozwoju Xenopus czynnik transkrypcyjny FoxI1e/Xema aktywuje różnicowanie naskórka i tłumi geny specyficzne dla endodermy i mezodermy w kapeluszach zwierząt (Suri i in., 2005). Sugeruje się, że FoxI1e jest aktywny, zanim ektoderma różnicuje się w naskórek i ośrodkowy układ nerwowy.
Identyfikacja FoxI1e
Mir i wsp., 2005 zidentyfikowali FoxI1e (Xema), wybierając geny, które były regulowane w dół pod wpływem sygnałów indukujących mezodermę w ektodermie w porównaniu z regionem wegetatywnym wczesnego zarodka blastuli . Zaobserwowano również wysoką ekspresję tego genu w czapkach zwierzęcych w zarodkach pozbawionych VegT w porównaniu z typem dzikim.
Lokalizacja w komórce
mRNA FoxI1e ulega ekspresji zygotycznie (stadium 8.5) i osiąga wyższy poziom ekspresji we wczesnej fazie gastrulacji i utrzymuje ten poziom w neuruli, pączku ogonowym aż do wczesnych stadiów kijanki. FoxI1e ma szczególny mozaikowy wzór ekspresji, jest wyrażany najpierw w ektodermie grzbietowej, a gdy rozwija się gastrula, ekspresja przechodzi przez stronę brzuszną, a jej ekspresja jest regulowana w dół po stronie grzbietowej, gdy tworzy się płytka nerwowa. FoxI1e jest zależny od sygnałów BMP na etapie neuruli, ograniczając lokalizację FoxI1e do brzusznej strony ektodermy.
Funkcja i regulacja białek
FoxI1e/Xema należy do klasy FoxI1 rodziny czynników transkrypcyjnych główki widelca, o której wiadomo, że bierze udział w tworzeniu mezodermy, rozwoju oczu i specyfikacji głowy brzusznej. Zaproponowano, że Notch i/lub NODAL , wyrażane w regionie roślinnym/mezodermy wczesnego zarodka blastuli , mogą potencjalnie być inhibitorami FoxI1e.
Utrata i zysk funkcji
Hamowanie dojrzewania mRNA FoxI1e przez morfolino blokujące splicing wykazuje wady rozwojowe w rozwoju naskórka i układu przepuszczalnego oraz regulację w dół genów specyficznych dla ektodermy, podczas gdy nadekspresja FoxI1e hamuje tworzenie mezodermy i endodermy. Struktury roślinne tworzą późne masy blastuli, które normalnie dawałyby początek endodermie i mezodermie, po wstrzyknięciu mRNA FoxI1e są zdolne do ekspresji markerów specyficznych dla ektodermy (pan-ektodermalna E-kadheryna, cytokeratyna nabłonkowa, marker grzebienia nerwowego Ślimak i marker nerwowy Sox- 2), podczas gdy ekspresja markerów endodermalnych (endodermina, Xsox17a) zmniejszyła się.
XFDL156
Biologiczna rola XFDL156
Białko p53 wiąże się z promotorami wczesnych genów mezodermy. p53 jest transkryptem zdeponowanym przez matkę, który tworzy kompleks czynnika transkrypcyjnego z Smad2 i kieruje ekspresją genów zaangażowanych w indukcję mezodermy i aktywację docelowych genów TGFβ. Białko palca cynkowego (Zn) XFDL159, wyrażane w kapeluszu zwierzęcym, działa jako czynnik ektodermalny, który określa ektodermę poprzez hamowanie genów aktywujących p53 do różnicowania mezodermy.
Identyfikacja XFDL156
Konstruowanie biblioteki cDNA z czapeczek zwierzęcych na etapie 11,5, klonowanie do wektora ekspresyjnego i generowanie mRNA. Syntetyczny RNA następnie wstrzyknięto do zarodków i uzyskano czapeczki zwierzęce z tych zebranych zarodków i poddano aktywiny . Xbra odzyskano przez wybranie klonu, który tłumi mezodermalny marker Xbra.
Lokalizacja XFDL156
Ponieważ XFDL156 jest czynnikiem, który oddziałuje z p53, lokalizacja tego białka jest w jądrze (Sasai i in., 2008). MRNA XFDL156 jest odkładany przez matkę, a następnie wyrażany zygotycznie. Oś czasu ekspresji genów pokazuje wyższy poziom ekspresji we wczesnej gastruli i połowę spadku ekspresji w środkowej gastruli, a do 20. etapu ekspresja zanika.
Funkcja białka XFDL156
Palec cynkowy XFDR wiąże się z regionem regulatorowym p53 zlokalizowanym w domenie C-końcowej, a na jego ekspresję nie wpływa obecność czynników transkrypcyjnych aktywiny, FoxI1e czy XLPOU91.
Utrata i zysk funkcji w XFDL156
Utrata funkcji przez morfolino powoduje nieprawidłowe różnicowanie mezodermy w obszarach ektoedermy; jest to spowodowane desupresją markerów mezodermalnych (Xbra, VegT i Mix.2). Wzmocnienie funkcji powoduje spadek ekspresji markerów mezodermalnych.
Ochrona homologów XFDL u innych gatunków
Ludzkie i mysie homologi XFDR156 są w stanie uzupełnić funkcję XFDR polegającą na interakcji z p53 i hamowaniu jego działania jako czynnika transkrypcyjnego.
Indukcja ektodermy we wczesnej blastuli w zarodku Xenopus .
