Streptamer

Technologia Streptamer umożliwia odwracalną izolację i barwienie limfocytów T specyficznych dla antygenu . Ta technologia łączy obecną metodę izolacji komórek T ze znacznikiem Strep technologia. Zasadniczo komórki T są rozdzielane poprzez ustanowienie specyficznej interakcji między komórką T będącą przedmiotem zainteresowania a cząsteczką, która jest sprzężona z markerem, co umożliwia izolację. Odwracalność tej interakcji i niskie temperatury, w których jest przeprowadzana, pozwalają na izolację i charakterystykę funkcjonalnych limfocytów T. Ponieważ komórki T pozostają fenotypowo i funkcjonalnie nie do odróżnienia od komórek nieleczonych, metoda ta oferuje nowoczesne strategie w badaniach klinicznych i podstawowych komórek T.

Klasyczne metody w badaniach komórek T

Limfocyty T odgrywają ważną rolę w adaptacyjnym układzie odpornościowym . Są zdolne do organizowania, regulowania i koordynowania złożonych odpowiedzi immunologicznych. Z funkcją lub nieprawidłowym działaniem limfocytów T związanych jest wiele istotnych klinicznie aspektów: choroby autoimmunologiczne , zwalczanie patogenów wirusowych lub bakteryjnych , rozwój raka lub reakcje przeszczep przeciw gospodarzowi. W ciągu ostatnich lat różne metody ( test ELISpot , barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, test sekrecji ) zostały opracowane do identyfikacji limfocytów T, ale tylko procedury głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) umożliwiają identyfikację i oczyszczanie limfocytów T swoistych dla antygenu niezależnie od ich statusu funkcjonalnego.

Zasadniczo procedury MHC wykorzystują ligand receptora komórek T (TCR), który jest kompleksem MHC-peptyd, jako sondę barwiącą. MHC oddziałuje z TCR, który z kolei ulega ekspresji na komórkach T. Ponieważ interakcje TCR-MHC mają tylko bardzo słabe powinowactwo do siebie, monomeryczne kompleksy MHC-epitop nie mogą zapewnić stabilnego wiązania. Ten problem można rozwiązać stosując multimeryzowane epitopy MHC, które zwiększają awidność wiązania , a zatem umożliwiają stabilne wiązanie. Fluorochromy skoniugowane z multimerami MHC można następnie zastosować do identyfikacji komórek T przez cytometria przepływowa . Obecnie cząsteczki MHC mogą być wytwarzane rekombinacyjnie razem z peptydami antygenowymi, które są znane z szybko rosnącej liczby chorób.

Technologia Streptameru

Szkielet Streptameru

Zasada barwienia Streptamerem łączy klasyczną metodę izolacji limfocytów T za pomocą multimerów MHC z technologią Strep-tag /Strep-Tactin. Znacznik Strep jest krótką sekwencją peptydową, która wykazuje umiarkowane powinowactwo wiązania do miejsca wiązania biotyny w zmutowanej cząsteczce streptawidyny, zwanej Strep-Tactin. W przypadku technologii Streptamer cząsteczki Strep-Tactin są multimeryzowane i tworzą „szkielet”, tworząc w ten sposób platformę do wiązania się z białkami znakowanymi paciorkowcami. Dodatkowo szkielet Strep-Tactin ma znacznik fluorescencyjny, aby umożliwić analizę metodą cytometrii przepływowej. Inkubacja białek fuzyjnych MHC-Strep-tag ze szkieletem Strep-Tactin skutkuje utworzeniem multimeru MHC, który jest zdolny do swoistego dla antygenu barwienia komórek T.

Odwracalne barwienie

Ponieważ cząsteczka d-biotyny ma znacznie większe powinowactwo do Strep-Tactin niż Strep-tag, może skutecznie konkurować o miejsce wiązania. Dlatego multimer MHC oparty na interakcji Strep-tag z Strep-Tactin łatwo ulega rozerwaniu w obecności stosunkowo niskich stężeń d-biotyny. Bez szkieletu Strep-Tactin pojedyncze białka fuzyjne MHC-Strep-tag spontanicznie odłączają się od TCR komórki T, z powodu słabego powinowactwa wiązania (monomeryczne kompleksy MHC-epitop nie mogą zapewnić stabilnego wiązania, patrz powyżej).