Znacznik paciorkowca
System Strep-tag jest metodą umożliwiającą oczyszczanie i wykrywanie białek metodą chromatografii powinowactwa . Strep -tag II to syntetyczny peptyd składający się z ośmiu aminokwasów ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Ta sekwencja peptydowa wykazuje wewnętrzne powinowactwo do Strep-Tactin, specjalnie opracowanej streptawidyny i mogą być połączone N- lub C-końcowo z rekombinowanymi białkami. Wykorzystując wysoce specyficzną interakcję, paciorkowcami można izolować w jednym etapie z surowych lizatów komórkowych. Ponieważ Strep jest eluowany w łagodnych, fizjologicznych warunkach, jest szczególnie odpowiedni do wytwarzania funkcjonalnych białek.
Rozwój i biochemia znacznika Strep
Streptawidyna jest tetramerycznym białkiem eksprymowanym w Streptomyces avidinii . Ze względu na wysokie powinowactwo streptawidyny do witaminy H ( biotyna ), streptawidyna jest powszechnie stosowana w biologii molekularnej i biotechnologii . Znacznik Strep został pierwotnie wybrany z biblioteki genetycznej, aby specyficznie wiązał się z proteolitycznie obciętą „rdzeniową” wersją streptawidyny. Przez lata tag Strep był systemowo optymalizowany, aby umożliwić większą elastyczność w wyborze miejsca przyczepu. Co więcej, jego partner interakcji, streptawidyna, również został zoptymalizowany w celu zwiększenia zdolności wiązania peptydów, co zaowocowało opracowaniem Strep-Tactin. Powinowactwo wiązania Strep-tag do Strep-Tactin jest prawie 100 razy wyższe niż w przypadku Strep-tag do streptawidyny. Tak zwany system Strep-tag, składający się z Strep-tag i Strep-Tactin, okazał się szczególnie przydatny do funkcjonalnej izolacji i analizy kompleksów białkowych w badania proteomu .
Zasada Strep-tag
Podobnie jak inne znaczniki o krótkim powinowactwie ( znacznik His , znacznik FLAG ), znacznik Strep można łatwo połączyć z rekombinowanymi białkami podczas subklonowania jego cDNA lub genu . Do jego ekspresji dostępne są różne wektory dla różnych organizmów gospodarzy ( E. coli , drożdży , owadów i komórek ssaków ). Szczególną zaletą Strep-tag jest jego raczej mały rozmiar i fakt, że jest biochemicznie prawie obojętny . Dlatego nie ma to wpływu na fałdowanie lub wydzielanie białek i zwykle nie zakłóca funkcji białek. Strep-tag jest szczególnie przydatny do analizy białek funkcjonalnych, ponieważ procedurę oczyszczania można prowadzić w warunkach fizjologicznych. Pozwala to nie tylko na izolację wrażliwych białek w stanie natywnym, ale także na oczyszczanie nienaruszonych kompleksów białkowych, nawet jeśli tylko jedna podjednostka zawiera znacznik.
W pierwszym etapie cyklu oczyszczania Strep-tag, lizat komórkowy zawierający białko fuzyjne Strep-tag jest nakładany na kolumnę z unieruchomioną Strep-taktyną (etap 1). Po tym, jak znakowane białko specyficznie związało się ze Strep-Tactin, następuje krótki etap przemywania buforem fizjologicznym (np. sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS) usuwa wszystkie inne białka gospodarza (etap 2). Wynika to z niskiej tendencji Strep-Tactin do niespecyficznego wiązania białek. Następnie oczyszczone białko fuzyjne Strep-tag jest delikatnie eluowane niskim stężeniem destiobiotyny, która specyficznie konkuruje o kieszeń wiążącą biotynę (etap 3). W celu regeneracji kolumny usuwa się destiobiotynę przez zastosowanie roztworu zawierającego HABA (żółty barwnik azowy ). Usunięcie destiobiotyny jest sygnalizowane zmianą barwy z żółto-pomarańczowej na czerwoną (etap 4+5). Na koniec roztwór HABA jest wypłukiwany niewielką objętością buforu przepływowego, dzięki czemu kolumna jest gotowa do użycia do następnego cyklu oczyszczania.
Aplikacje ze znacznikami Strep
System Strep-tag oferuje selektywne narzędzie do oczyszczania białek w warunkach fizjologicznych. Otrzymane białka są bioaktywne i charakteryzują się bardzo wysoką czystością (powyżej 95%). Ponadto system Strep-tag może być stosowany do wykrywania białek w różnych testach. W zależności od warunków doświadczalnych, przeciwciała Strep-tag lub Strep-Tactin, z enzymem (np. peroksydaza chrzanowa (HRP), fosfataza alkaliczna (AP)) lub fluorescencją (np. zielone białko fluorescencyjne (GFP)). Jeśli wymagana jest wysoka czystość, lizat można oczyścić, najpierw stosując Strep-Tactin, a następnie przeprowadzić drugą analizę z użyciem przeciwciał przeciwko Strep-tag. Zmniejsza to zanieczyszczenie nieswoistymi związanymi białkami, które może wystąpić w niektórych rzadkich przypadkach.
Za pomocą systemu wykrywania Strep-tag można przeprowadzić następujące testy:
- jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa
- Badania interakcji białko:białko
- Kolonie blot, dot blot , Western blot i ELISA
- Badanie przesiewowe klonów o pozytywnej ekspresji
- Immunocytochemia i immunohistochemia
- Badania lokalizacji i kierowania białek
Ponieważ znacznik Strep jest zdolny do izolowania kompleksów białkowych, można również przeprowadzić strategie badania interakcji białko-białko. Inną opcją jest immobilizacja białek Strep-tag za pomocą swoistego przeciwciała o wysokim powinowactwie na mikropłytkach lub biochipach.
System Strep-Tag/StrepTactin jest również używany w jednocząsteczkowych pęsetach optycznych i eksperymentach z mikroskopem sił atomowych , wykazując wysoką stabilność mechaniczną porównywalną z najsilniejszymi dostępnymi obecnie wiązaniami niekowalencyjnymi.