Białko wiążące maltozę

Białko peryplazmatyczne wiążące maltozę/maltodekstrynę
1fqc mbp.png
Białko wiążące maltozę z Escherichia coli , ze związaną cząsteczką cukru pokazaną jako czerwone kulki, z .
Identyfikatory
Organizm Escherichia coli
Symbol Mężczyzna
UniProt P0AEX9
Szukaj
Struktury Model szwajcarski
Domeny InterPro

Białko wiążące maltozę ( MBP ) wchodzi w skład układu maltoza / maltodekstryna Escherichia coli , który odpowiada za pobieranie i efektywny katabolizm maltodekstryn. Jest to złożony system regulacyjny i transportowy obejmujący wiele białek i kompleksów białkowych. MBP ma przybliżoną masę cząsteczkową 42,5 kilodaltonów .

Struktura i składanie

MBP jest kodowany przez gen malE Escherichia coli . Gen malE koduje polipeptyd prekursorowy (396 reszt aminokwasowych ), który daje dojrzały MBP (370 reszt) po rozszczepieniu NH2 - końcowego przedłużenia (26 reszt). Formy prekursorowe i dojrzałe MBP nie zawierają żadnych cysteiny .

MBP jest białkiem monomerycznym. Struktury krystaliczne wykazały, że MBP jest podzielony na dwie odrębne domeny kuliste , które są połączone trzema krótkimi segmentami polipeptydowymi. Dwie domeny są oddzielone głębokim rowkiem, który zawiera miejsce wiązania maltozy/maltodekstryny. Porównanie struktur ligandowanych i nieligandowanych postaci MBP wykazało, że wiązanie maltozy indukuje główną zmianę konformacyjną , która zamyka rowek przez sztywny ruch dwóch domen wokół łączącego zawiasu polipeptydowego.

Zarówno prekursorowe, jak i dojrzałe formy MBP są funkcjonalne dla wiązania maltozy. Wydłużenie końca NH2 zmniejsza szybkość fałdowania formy prekursorowej MBP w stosunku do jej postaci dojrzałej co najmniej 5-krotnie, ale nie ma wpływu na szybkość fałdowania . Równowagowe rozwinięcie MBP można modelować za pomocą mechanizmu dwustanowego o stabilności ∆G(H 2 O) równej 9,45 kcal mol -1 w temperaturze 25°C, pH 7,6.

Lokalizacja i eksport

MBP jest eksportowany do przestrzeni peryplazmatycznej E. coli . NH2 - końcowe przedłużenie MBP, określane również jako peptyd sygnałowy , pełni dwie role: (i) spowalnia fałdowanie nowo zsyntetyzowanego polipeptydu i (ii) kieruje ten polipeptyd do błony i translokonu SecYEG . Po złożeniu prekursor nie może już wejść na ścieżkę translokacji. Wprowadzenie naładowanej reszty aminokwasowej lub proliny reszta w hydrofobowym rdzeniu peptydu sygnałowego jest wystarczająca do zablokowania eksportu. Wadliwy eksport zmutowanych MBP jest zgodny z konformacją alfa-helikalną i interakcjami hydrofobowymi peptydu sygnałowego w jego interakcji z translokonowym białkiem motorycznym SecA .

Kontrola ekspresji

Gen malE , kodujący MBP, należy do regulonu Mal u E. coli , który składa się z dziesięciu genów, których produkty są ukierunkowane na efektywne pobieranie i wykorzystanie maltozy i maltodekstryn . Wszystkie geny zaangażowane w transport maltozy/maltodekstryny, w tym malE , są skupione w regionie malB E. coli i zorganizowane w dwa rozbieżne operony : malE-malF-malG i malK-lamB . Transkrypcja _ miejsca startowe w promotorach malEp i malKp są oddalone od siebie o 271 par zasad.

malEp i malKp są synergistycznie aktywowane przez białko MalT, aktywator regulatora Mal oraz białko CRP receptora cAMP . Ta aktywacja jest procesem sprzężonym, który obejmuje przejście od malEp do malKp : dwa miejsca wiążące MalT; trzy miejsca wiązania CRP i dwa nakładające się zestawy trzech miejsc wiązania MalT, przesunięte o trzy pary zasad. Aktywacja transkrypcji wymaga związania trójfosforanu adenozyny (ATP) i maltotriozy z MalT oraz związania cyklicznego AMP do dimeru CRP. Nieuligandowana forma MalT jest monomeryczna, podczas gdy jego postać zligandowana, w obecności ATP i maltotriozy, jest oligomeryczna.

Użyj jako wektora białkowego i peptydowego

MBP stosuje się w celu zwiększenia rozpuszczalności rekombinowanych białek eksprymowanych w E. coli . W tych systemach białko będące przedmiotem zainteresowania jest często wyrażane jako białko fuzyjne MBP , co zapobiega agregacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Mechanizm, dzięki któremu MBP zwiększa rozpuszczalność, nie jest dobrze poznany. Ponadto MBP może być sam stosowany jako znacznik powinowactwa do oczyszczania rekombinowanych białek. Białko fuzyjne wiąże się z kolumnami amylozy podczas gdy wszystkie inne białka przepływają. Fuzję MBP-białko można oczyścić przez elucję kolumny maltozą. Po uzyskaniu białka fuzyjnego w postaci oczyszczonej, białko będące przedmiotem zainteresowania jest często odcinane od MBP za pomocą specyficznej proteazy , a następnie może być oddzielone od MBP za pomocą chromatografii powinowactwa .

Pierwsze badanie zależności między strukturą a funkcjami MBP przeprowadzono przez losowe wstawienie krótkiego fragmentu DNA, kodującego miejsce restrykcyjne BamHI , do genu malE . Niektóre wstawki wpływały na funkcje MBP, podczas gdy inne były liberalne. Miejsca permisywne, które były wewnętrzne dla MBP, wykorzystano do wstawienia peptydów antygenowych i prowokacji odpowiedzi immunologicznej u myszy. Insercje końcowe 3'-OH wykorzystano do stworzenia białek fuzyjnych i opracowania zastosowania MBP jako uchwytu powinowactwa do oczyszczania obcych białek i peptydów metodą chromatografii powinowactwa na usieciowanej amylozie i elucji maltozą w łagodnych warunkach fizykochemicznych. Kilka opracowano wektory plazmidowe w celu ułatwienia ekspresji i oczyszczania takich białek fuzyjnych.

Gdy rekombinowany MBP zawiera peptyd sygnałowy , białko fuzyjne może zostać wyeksportowane do przestrzeni peryplazmatycznej , co ułatwia jego oczyszczanie , ponieważ płyn peryplazmatyczny zawiera tylko ograniczoną liczbę białek i może być odzyskany przez szok osmotyczny lub przepuszczalność bakterii błonę zewnętrzną z antybiotykami , takimi jak Polimyksyna B. Taki eksport białka fuzyjnego do przestrzeni peryplazmatycznej umożliwia tworzenie wiązań dwusiarczkowych np. w białku pasażerskim przeciwciał . Obce białka, które są eksportowane lub wydzielane w ich natywnym organizmie, mogą być zwykle eksportowane do E. coli przez fuzję z MBP. Przykłady białek cytoplazmatycznych, które mogą być eksportowane przez fuzję z MBP, obejmują monomeryczną polimerazę Klenowa i dimeryczne białko genu V faga M13 . Gdy zrekombinowany MBP zawiera wadliwy peptyd sygnałowy lub nie zawiera peptydu sygnałowego, białko fuzyjne pozostaje w cytoplazmie bakteryjnej, skąd można je odzyskać przez rozbicie komórek .

Fuzja białek z MBP zazwyczaj zwiększa ich rozpuszczalność i ułatwia ich prawidłowe fałdowanie, dzięki czemu białka fuzyjne są najczęściej dwufunkcyjne. Ponadto takie fuzje mogą ułatwiać krystalizację trudnych białek, np. białek błonowych. Struktury skrystalizowanego białka często można rozwiązać za pomocą krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem wymiany molekularnej na znanej strukturze MBP.

Zobacz też

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Maltose-binding_protein&oldid=1139414901 ”