Fluorescencyjny bioczujnik glukozy
Bioczujniki fluorescencyjne glukozy to urządzenia mierzące stężenie glukozy u pacjentów z cukrzycą za pomocą czułego białka , które przekazuje stężenie za pomocą fluorescencji , co stanowi alternatywę dla amperometrycznej detekcji glukozy . Ze względu na rozpowszechnienie cukrzycy jest głównym motorem budowy biosensorów fluorescencyjnych. Niedawny rozwój został zatwierdzony przez FDA, umożliwiając nowy ciągłego monitorowania glukozy o nazwie EverSense, który jest 90-dniowym monitorem glukozy wykorzystującym bioczujniki fluorescencyjne.
Aplikacja
Kontrolowanie poziomu glukozy ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania początku szkód spowodowanych przez cukrzycę. W konsekwencji, w połączeniu z podawaniem insuliny, podstawowym wymogiem dla pacjentów z cukrzycą jest regularne monitorowanie poziomu glukozy we krwi. Powszechnie stosowane obecnie systemy monitorowania mają tę wadę, że liczba odczytów jest poniżej optymalnej, ze względu na ich zależność od kropli świeżej krwi. Niektóre ciągłe monitory glukozy są dostępne w handlu, ale mają poważną wadę krótkiej żywotności sondy. Większość z nich działa amperometrycznie. W rezultacie podejmowane są wysiłki w celu stworzenia czujnika, który opiera się na innym mechanizmie, takim jak zewnętrzna spektroskopia w podczerwieni lub biosensory fluorescencyjne.
pomocą fluorescencji, z których pierwszą i najbardziej powszechną jest test kompetycyjny Freta między glukozą a wyznakowanym polimerem glukozy o miejsce wiązania konkanawaliny A. Na przestrzeni lat, stosując kombinację racjonalnego projektowania i badań przesiewowych, zbadano wiele możliwych kombinacji czujnika fluorescencyjnego do oznaczania glukozy z różnym skutkiem: w większości podejść stężenie glukozy przekłada się na zmianę fluorescencji za pomocą Freta para lub przy użyciu wrażliwych na środowisko (solwatochromowych) barwników w różnych kombinacjach, fluorescencyjna mała cząsteczka, białko lub kropka kwantowa zostały użyte w połączeniu z ugrupowaniem wiążącym glukozę, fluoroforem funkcjonalizowanym kwasem boronowym lub białkiem, takim jak oksydaza glukozowa, konkanawalina A, białko wiążące glukozę/galaktozę, dehydrogenazę glukozową i glukokinazę. Ogólnie rzecz biorąc, zmiana obserwowana w Fret jest niewielka (patrz poniżej).
Teoria fluorescencji
Fluorescencja to właściwość występująca w niektórych cząsteczkach, zwanych fluoroforami , w których emitują one foton krótko po pochłonięciu fotonu o większej długości fali energii.
Mówiąc dokładniej, aby elektron znajdujący się na zewnętrznej orbicie cząsteczki mógł przeskoczyć z orbitalu stanu podstawowego na orbital stanu wzbudzonego, potrzebuje określonej ilości energii, która w przypadku chromoforów (cząsteczek pochłaniających światło), można uzyskać pochłaniając foton o energii równej lub nieco wyższej. Stan ten jest krótkotrwały, a elektron powraca na orbital przyziemny, tracąc energię albo w postaci ciepła, albo w przypadku fluoroforów emitując foton, który na skutek utraty różnicy energii pochłoniętego foton i wymagana energia wzbudzenia będą miały niższą energię niż foton pochłonięty lub, wyrażone jako długość fali, emitowany foton będzie miał dłuższą długość fali. Różnica między dwiema długościami fal nazywana jest przesunięciem Stokesa .
Tę właściwość można znaleźć w kropkach kwantowych , niektórych lantanowcach i niektórych cząsteczkach organicznych ze zdelokalizowanymi elektronami .
Te wzbudzone cząsteczki mają wzrost pędu dipolowego iw niektórych przypadkach mogą ulegać wewnętrznemu przegrupowaniu ładunku. Kiedy posiadają grupę odciągającą elektrony i grupę dostarczającą elektrony na przeciwległych końcach struktury rezonansowej, mają duże przesunięcie rozkładu ładunku w cząsteczce, co powoduje reorientację cząsteczek rozpuszczalnika do mniej energetycznego układu, zwanego relaksacją rozpuszczalnika. W ten sposób energia stanu wzbudzonego maleje, a zakres różnicy energii zależy od polarności rozpuszczalnika otaczającego cząsteczkę.
Alternatywnym podejściem jest zastosowanie barwników solwatochromowych , które zmieniają swoje właściwości (intensywność, okres półtrwania i widma wzbudzenia i emisji) w zależności od polarności i ładunku ich otoczenia. Dlatego czasami są one luźno określane jako barwniki wrażliwe na środowisko. Mogą one być umieszczone na określonych resztach, które albo zmieniają swoje rozmieszczenie przestrzenne z powodu zmiany konformacyjnej wywołanej przez glukozę, albo znajdują się w kieszeni wiążącej glukozę, dzięki czemu wypieranie wody obecnej przez glukozę zmniejsza polarność.
Dodatkową właściwością fluorescencji, która znalazła szerokie zastosowanie, jest rezonansowy transfer energii Förstera ( Fret ), w którym energia wzbudzonego elektronu jednego fluoroforu, zwanego donorem, jest przekazywana do pobliskiego barwnika akceptorowego, albo ciemnego wygaszacza ( nieemitujący chromofor) lub inny fluorofor, którego widmo wzbudzenia pokrywa się z widmem emisyjnym barwnika donorowego, co skutkuje zmniejszoną fluorescencją.
Do celów wykrywania właściwość ta jest na ogół wykorzystywana albo w połączeniu z biomolekułą, taką jak białko, które ulega zmianie konformacyjnej po związaniu ligandu, zmieniając odległość między dwoma znacznikami na tym białku, lub w teście kompetycyjnym, w którym analit musi współzawodniczyć ze znanym stężeniem znakowanego ligandu o znakowanym miejscu wiązania białka. Dlatego Fret między miejscem wiązania a konkurującym ligandem zmniejsza się, gdy stężenie analitu wzrasta. Na ogół konkurującym ligandem w przypadku glukozy jest dekstran , długi polimer glukozy przyłączony do rusztowania lub enzymu.
Rezonansowy transfer energii Förstera
Na przestrzeni lat, stosując kombinację racjonalnego projektowania i procedur przesiewowych, stworzono wiele możliwych typologii czujników fluorescencyjnych do oznaczania glukozy, z różnym powodzeniem. Ogólnie rzecz biorąc, czujniki te opierają się albo na progu progu , albo na wrażliwości na zmiany polaryzacji, aby przełożyć stężenie glukozy na intensywność fluorescencji.
Oprócz fluoroforów czujniki te zawierają cząsteczkę, która nadaje specyficzność glukozie, zwykle białko. W tym celu stosowano różne białka, często z różnymi laboratoriami koncentrującymi się na jednym konkretnym białku.
Pierwszy bioczujnik glukozy opisany w literaturze został wykonany w 1982 roku przez grupę Schultza przy użyciu testu współzawodnictwa Freta między glukozą a znakowanym polimerem glukozy o miejsce wiązania konkanawaliny A uwięzionej w wydrążonym włóknie dializacyjnym. W rezultacie Con A był szeroko stosowany w kolejnych czujnikach w kilku laboratoriach, jednak Con A ma wadę polegającą na wysokiej toksyczności i niskiej odwracalności. W rezultacie inne białka wiążące glukozę były i są badane przez kilka laboratoriów.
Fret otoczony włóknami dializacyjnymi , który przez kilka lat był testowany na modelach zwierzęcych.
Natomiast bioczujniki amperometryczne mogą wykorzystywać tylko oksydazę glukozową jako białko, ponieważ jest to enzym redoks. Białko to było również używane w wykrywaniu fluorescencyjnym po prostu jako apoenzym lub jako holoenzym. Wyjątkiem od tej grupy czujników jest grupa Biocapacitor A Sode'a, która zamiast tego opiera się na dehydrogenazie glukozowej.
Aktywność oksydazy glukozowej została również wykorzystana do stworzenia czujników fluorescencyjnych / fosforescencyjnych opartych na czasie życia, wykorzystując fakt, że białko utlenia glukozę, wykorzystując tlen cząsteczkowy, a tlen tłumi fluorescencję rutenu. Dokonał tego Uwira i współpracownicy w 1984 roku, a następnie kilka grup.
Konkretnie, Endo i Pasic wykorzystali ten test wygaszania tlenu oparty na GOx, aby stworzyć czujnik oparty na włóknach, podczas gdy McShane wykorzystuje test wygaszania tlenu oparty na GOx w mikrosferach wykonanych w celu wstrzyknięcia podskórnego w celu stworzenia tego, co grupa stworzyła „inteligentny tatuaż”, czujnik działający nieinwazyjnie, zgłaszający się przez skórę, wykorzystując fakt, że skóra jest przepuszczalna dla światła bliskiej podczerwieni. Ponadto grupa ta stworzyła kilka testów ukończenia Fret, najpierw przy użyciu ConA (TRITC-Con A / FITC-dekstran (500 kDa)), ale następnie w 2004 r . ), aw 2009 testowanie czujników (QSY-21-apo-GOx /Alexa647-dextran) w mikrosferach. Kilka innych grup stworzyło inteligentne tatuaże i zostały one omówione poniżej.
Jeden konkretny test wygaszania tlenem rutenu GOx został zastosowany w badaniu w grupie Ingo Klimanta, w pełni funkcjonalnym czujniku do pomiaru poziomu glukozy u zdrowego ochotnika. Czujnik skonstruowano poprzez funkcjonalizację czujnika tlenu oksydazą glukozową i wprowadzenie go do zewnętrznej części cewnika służącego do monitorowania.
Apoenzymy nadal mogą wiązać glukozę, ale ze względu na brak kofaktorów (in vitro) nie mogą katalizować ich reakcji, więc są mniej podatne na uszkodzenia.
Inne wykorzystane białka to glukokinaza z termofila z grupy D'auria i białko wiążące glukozę-galaktozę ( Ggbp ), które nie jest enzymem, ale białkiem peryplazmatycznym biorącym udział w chemotaksji, która przechodzi dużą zmianę konformacyjną.
Większość fluoroforów używanych w czujnikach to małe cząsteczki, chociaż niektóre czujniki zostały wykonane przy użyciu kropek kwantowych (QD) lub białka fluorescencyjnego.
Czujniki zostały wykonane przy użyciu QD jako donorów Freta i małej cząsteczki lub nanocząsteczki złota (ciemny wygaszacz) jako akceptorów. Przykładem tego pierwszego jest sensil Loeba, system światłowodowy, w którym kropka kwantowa jest przyłączona do ConA, podczas gdy tetrametylorodamina jest przyłączona do cyklodekstranu, który z kolei jest przyłączony do rusztowania z diakrylanu PEG. Przykładem tego ostatniego jest Tang z QDs-ConA-beta-CDs-AuNPs.
Białko fluorescencyjne można przekształcić w białko fuzyjne z pożądanym białkiem, z pominięciem etapów znakowania. Shultz stworzył Ggbp z dwoma GFP na każdym końcu. Nie odnotowano tego w literaturze, ale teoretycznie można to poprawić, przeprowadzając ukierunkowaną ewolucję in vitro przy użyciu FACS. Nie jest to łatwe do zrobienia przez etykietowanie, chociaż Pitner próbował przeprowadzić badanie przesiewowe.
Fluorescencja nie jest jedynym rodzajem luminescencji osiągalnym w układach biologicznych: chemiluminescencja, wytwarzanie światła w wyniku reakcji chemicznych, jest wytwarzana przez niektóre białka, takie jak aqueorin z symbiontu meduz i lucyferaza z symbiontu świetlików. Zostały one użyte do wytworzenia czujników glukozy: Daunert wytwarza aqueoryny z podziałem Ggbp , aw 2009 Koji Sode wyprodukował Ggbp -lucyferazę z Asp459Asn (Glc nie Gal).
Oprócz barwników małocząsteczkowych zastosowano białka fluorescencyjne: Jedna grupa wykonała czujnik Fret w bliskiej podczerwieni (NIR) wykryty za pomocą czasowo-rozdzielczej / nanotomografii allofikocyjaniny-ConA / zieleni malachitowej-dekstranu, w odniesieniu do Freta z allofikocyjaniną, która MacColl dokonał przeglądu.
Oprócz białka jako ugrupowania wiążącego glukozę, zastosowano cząsteczki funkcjonalizowane kwasem boronowym . Kwas boronowy wiąże się z sąsiednimi grupami, korzystnie hydroksylowymi; dlatego ma duże powinowactwo do węglowodanów. Wykorzystanie grupy kwasu boronowego do rozpoznawania sacharydów było szeroko badane przez Shinkai, Jamesa i ich współpracowników. Aby to wykorzystać, podjęto kilka podejść.
Jednym podejściem jest wygaszanie Freta , w którym system może działać poprzez modulację wygaszania barwnika przez viologen funkcjonalizowany kwasem boronowym.
Alternatywnym podejściem jest fotoindukowany transfer elektronów (PET), mechanizm wygaszania fluorescencji dzięki bogatej w elektrony trzeciorzędowej grupie aminowej w pobliżu fluoroforu, na którą wpływa zmiana ładunku pobliskiej grupy boronianowej, gdy glukoza jest związana . Zostało to użyte w połączeniu z czasem życia przez jedną grupę, nie tylko we fluorescencji, ale jako środek NMR do obrazowania za pomocą barwnika kwasu boronowego europu (3+) .
Barwniki wyczuwające środowisko
Większość czujników przyjmujących barwniki wrażliwe na środowisko wykorzystuje Ggbp , białko transportowe, które wiąże się z D-glukozą i D-galaktozą i przenosi je do związanego z błoną receptora Trg, wyzwalając chemotaksję bakterii w kierunku tego źródła glukozy. Należy do rodziny malG w Escherichia coli, która obejmuje białko wiążące maltozę, które w zależności od obecności glukozy może przyjąć dwie różne konformacje lub ewentualnie trzy, generując ruch zawiasowy o 31° między dwiema domenami kulistymi połączonymi zawiasem , która jest kieszenią wiążącą glukozę. Jego powinowactwo do glukozy wynosi K= 0,2 μM, czyli znacznie mniej niż zakres patofizjologiczny glukozy występujący w cukrzycy (1,7-33 mM). W konsekwencji przeprowadzono kilka badań w celu obniżenia powinowactwa Ggbp , co w przeciwnym razie skutkowałoby niemal wysyceniem Ggbp w całym patofizjologicznym stężeniu glukozy. Powinowactwo wiązania Ggbp zmienia się, gdy jest znakowane endosterycznie lub perysterycznie, więc powstało kilka mutantów, które działają w zakresie zbliżonym do patofizjologicznej glukozy.
Ggbp zawiera pięć reszt tryptofanu, z których dwie, W183 w miejscu wiązania i W284 w domenie N-końcowej (która może wiązać wapń), wpływają na widma autofluorescencji po związaniu glukozy.
Niektóre badania z Ggbp i barwnikami solwatochromowymi nie mają na celu stworzenia czujnika, ale wyjaśnienie chemii stojącej za zmianą konformacyjną Ggbp . Przykłady tego obejmują badanie wykorzystujące L255C z akrylodanem i rutenem na N-końcu, ujawniające trzy stany konformacyjne zamknięte i skręcone, fluorescencję i fosforescencję tryptofanu W183 w normalnych warunkach [52], pod wysokim ciśnieniem i z wapniem lub bez.
Sode i in. stworzyli serię mutantów Ggbp w celu zwiększenia Kd w postaci nieznakowanej w pobliżu zakresu fizjologicznego (Phe16Ala) i usunięcia specyficzności galaktozy (Asp14Glu).
Odpowiedź wrażliwego na środowisko barwnika przyłączonego do określonej reszty Ggbp zależy nie tylko od miejsca znakowania, które ma określone środowisko, ale także od natury barwnika, który oddziałuje różnie w zależności od swojej geometrii. Interakcja między danym barwnikiem a jego otoczeniem jest trudna do przewidzenia in silico. W rezultacie, w celu uzyskania działającego czujnika, w kilku niezależnych badaniach przeszukano zestaw wrażliwych na środowisko barwników przyczepionych do kilku możliwych miejsc w kieszeni wiążącej (miejsce endosteryczne), w pobliżu (miejsce perysteryczne) lub z dala od niego (miejsce allosteryczne) ).
Jedną z zalet Ggbp jest to, że w typie dzikim nie ma reszt cysteiny, co sprawia, że wprowadzenie tej reszty w określone miejsce jest idealne do znakowania.
Zespół kierowany przez Homme Hellinga przeprowadził dwa duże ekrany. W pierwszym (2002) stworzyli serię (320 konstruktów) znakowanych mutantów 11 bakteryjnych peryplazmatycznych białek wiążących, w tym Ggbp , dla których stworzyli dziewięć mutantów wprowadzających cysteinę w określone miejsce (Y10C, N15C, E93C, E149C, H152C, W183C, L255C, D257C, V296C) i zbadano odpowiedź po wyznakowaniu jednym z ośmiu barwników (piren (340, 390); akrylodan (390, 500); fluoresceina (485, 520); NBD (490, 540); NBDE (490, 530); JPW4039 (485, 590); JPW4042 (470, 640); i JPW4045 (470, 640)). Spośród 72 wykonanych kombinacji, Ggbp znakowany akrylodanem w pozycji W183C miał pięciokrotną zmianę i kd=5mM.
W kolejnym badaniu (2007), używając termostabilnego Ggbp z Thermotoga maritima, przeszukali pięć mutantów (Y13C, W14C, Y189C, S131C i M239C) z czterema barwnikami ( Ianbd , Acrylodan , Cy5 i Cy3) identyfikując koniugat Y13C-Cy5, co dało maksymalny wzrost o 50% i powinowactwo przy 15 mM.
Grupa kierowana przez Daunerta wykorzystała trzy mutanty endosteryczne (G148C, H152C i M182C) w połączeniu z czterema barwnikami (akrylodan, 1,5- IAEDANS , MDCC i ester Ianbd ) identyfikując M182C-MDCC, co dało 30% zmianę fluorescencji. Zupełnie inne podejście przyjął Pitner w BD, który użył pojedynczego barwnika ( Ianbd ) dołączonego do E149C jako punktu wyjścia do ukierunkowanego ekranu ewolucji, w którym tworzona jest biblioteka mutantów i wybierana dla „zwycięzców”, a mianowicie mutantów spełniających kryteria wyboru. Dzięki temu podejściu zidentyfikowali E149C/A213R/L238S z kd 10 mM i ośmiokrotnym wzrostem fluorescencji; ten mutant został później użyty do SPR.
Niezależnie inna grupa (J Pickup) przetestowała dwa mutanty (H152C i M182C) znakowane Badanem ( 6-bromoacetylo-2-dimetyloaminonaftalenem), związane z grupą tiolową cysteiny wprowadzonej w miejscu 152 (mutant H152C). Wykazało to trzykrotny wzrost (zmiana o 200%) po wysyceniu wiązania glukozy, co czyni go idealnym kandydatem na czujnik. Późniejsze prace, przyjmując mutacje zidentyfikowane przez Pitnera (powyżej), wygenerowały Ggbp znakowanego Badanem (H152C/A213R/L238S), ze stałą dysocjacji w ludzkim fizjologicznym zakresie glukozy (Km=11mM) i dwukrotnym wzrostem fluorescencji ( 100% zmiana).
Autofluorescencja tkankowa
Inna para artykułów sugeruje, że naturalna fluorescencja (autofluorescencja) tkanek może być wykorzystana do śledzenia stężeń glukozy. W badaniach tych wykorzystano fakt, że NAD(P)H w swojej zredukowanej postaci jest autofluorescencyjny i że metabolity, takie jak glukoza, powodują przewidywalny wzrost redukcji NAD(P)H .
Wyczuwanie na żywo
Alternatywnym sposobem pomiaru zmiany w środowisku barwników środowiskowych jest ich zmiana czasu życia, co może dawać lepsze wyniki w niektórych czujnikach, wykorzystując lantanowce lub np. wspomniany kompleks ruten (Ru) metal-ligand, albo z GOx, albo jako akceptor Freta barwnika wrażliwego na środowisko, jak w przypadku ANS26- Ggbp w kuwecie pokrytej rutenem, który wykazuje niewielki wzrost intensywności, ale znaczną zmianę w czasie życia.
Konstrukcja białka fluorescencyjnego to tylko jeden podsystem klinicznie wykonalnego urządzenia monitorującego: białko czujnikowe musi zostać unieruchomione, a jego fluorescencja musi zostać odczytana przez podsystem wykrywający, który z kolei informuje użytkownika.
W idealnej sytuacji detektor mógłby zostać wszczepiony unieruchomionym białkiem i zapytany za pomocą częstotliwości radiowej, jednak obecnie osiągnięto to tylko za pomocą czujników amperometrycznych. Ogólne podejście do czujników fluorescencyjnych polega na przyczepieniu białka do jednego końca światłowodu wszczepionego pod skórę, podczas gdy drugi koniec jest podłączony do podsystemu wykrywania, który obejmuje rozdzielacz ścieżki (włókno warstwowe lub lustro dichroiczne), aby umożliwić włóknu transmitować zarówno wzbudzenie, jak i emitowane światło, filtrowane źródło światła (ogólnie laser) i filtrowany fotodetektor (CCD lub PMT). Zebrane w ten sposób informacje są następnie analizowane za pomocą komputera.
Inteligentny tatuaż
Skóra przepuszcza światło bliskiej podczerwieni (NIR). W rezultacie barwniki bliskiej podczerwieni można mierzyć na skórze bez potrzeby stosowania światłowodu; zostało to nazwane „inteligentnym tatuażem” przez McShane'a, który stworzył test wygaszania tlenu w bliskiej podczerwieni zawarty w mikrosferach.
Istnieje jednak ograniczona ilość dostępnych w handlu barwników fluorescencyjnych i ograniczona ilość barwników wrażliwych na środowisko, takich jak cyjanina cy7. W rezultacie Pitner stworzył reaktywny czerwony barwnik Nilu, ale do tej pory nie przeprowadzono żadnych badań z czujnikiem Nilu czerwonego- Ggbp .
Niemniej jednak przeprowadzono kilka badań z barwnikami NIR. Pickup i Birch wykonali czujnik NIR Fret , mierzący zarówno zliczenia czasowo-rozdzielcze, jak i nanotomografię allofikocyjaniny-ConA / zieleni malachitowej-dekstranu, gdzie allofikocyjanina jest białkiem fluorescencyjnym NIR. W innym badaniu autofluorescencja NAPH, nośnika energii w komórkach, została oceniona jako wskaźnik pośredni.
Grupa BioTex Inc, kierowana przez McNicholsa i Ballerstadta, stworzyła czujnik NIR Fret oparty na ConA, z barwnikami NIR Alexa 647 i Alexa 750 (pierwotnie Alexa 647 i cy7) zamkniętymi we włóknie dializacyjnym przymocowanym do końca światłowodu, które nazwali „FAS” (fluorescencyjny). Aby poprawić stabilność, przyczepili białko do sephadexu, makroporowatego hydrożelu. Pomimo zmiany Fret wynoszącej zaledwie 35% w całym zakresie patofizjologicznym (prawdopodobnie 40% maksymalnej zmiany od braku glukozy do nasycenia), wykazano, że czujnik zmniejsza swoją funkcjonalność tylko o 20% po 450 dniach inkubacji w temperaturze 37°C (99°C). F) oraz do monitorowania glukozy, jak również czujnika Medtronic/Minimed CGMS w modelach zwierzęcych (mysz, świnia i pies); jednak ich deklarowanym celem jest stworzenie inteligentnego tatuażu.
Laboratorium Draper opracowuje również inteligentny tatuaż i obecnie przeprowadza testy na zwierzętach. Wydajność i tożsamość czujnika nie zostały ujawnione.
Kapsułkowanie w membranach dializacyjnych
Pomimo większej korzyści płynącej z inteligentnych tatuaży w porównaniu z transdermalnym światłowodem, nie wykazano jeszcze żadnego inteligentnego tatuażu in vivo, podczas gdy wykazano, że systemy oparte na włóknach są potencjalnymi czujnikami.
Większość czujników wymienionych w poprzednich sekcjach składała się ze znakowanych białek w roztworze. Jedynymi czujnikami, które poczyniły postępy w kierunku wszczepialnego czujnika, były albo czujniki testowe hartowania tlenem GOx-ruten, albo czujniki testowe konkurencji Fret ; do tej pory nie opublikowano żadnych wrażliwych na środowisko czujników barwnikowych przymocowanych na końcu światłowodu.
Aby biosensory oparte na włóknach działały, białko musi być unieruchomione na włóknie, które może zostać uwięzione w wydrążonej rurce wykonanej z membrany dializacyjnej lub uwięzione w hydrożelu.
Pusta rurka do dializy to rurka o średnicy poniżej milimetra, której ścianki są zbudowane z porowatej usieciowanej celulozy, zaprojektowanej tak, aby przepuszczać małe substancje rozpuszczone, ale nie duże biomolekuły, takie jak białko o granicy odcięcia w zakresie od 0,5 do 20 kDa. W rezultacie doskonale nadają się do zastosowań sensorycznych, w których analit może swobodnie dyfundować, podczas gdy białka nie, zarówno białko czujnika wewnątrz, jak i proteazy krwi/tkanki śródmiąższowej. W rzeczywistości czujnik GlucoDay firmy Menarini Diagnostics ma dłuższą żywotność, ponieważ wstrzykiwana sonda wykorzystuje membranę dializacyjną, chociaż w celu drastycznego zwiększenia szybkości dyfuzji jest połączona z pompą.
Zamknięcie w hydrożelu
Jeśli chodzi o jego zastosowanie w fluorescencyjnym wykrywaniu glukozy, pierwszy bioczujnik glukozy za pomocą fluorescencji, który, jak wspomniano, został wykonany w 1982 r . lab, a mianowicie J Schultza, w 2001 roku opublikowano inne badanie wykorzystujące włókna do mikrodializy przy użyciu czujnika Fret ConA, ale z innymi etykietami i przy użyciu sephadexu zamiast dekstranu (ten pierwszy był o kilka rzędów wielkości większy). Następnie dr Ballastardt dołączył do BioTex jako starszy naukowiec pod przewodnictwem dr Rogera McNicholsa, głównego naukowca, gdzie przez ostatnie siedem lat testowali wspomniany wcześniej czujnik FAS, który wykorzystywał ten sam system Fret w rurce do dializy . Mówiąc dokładniej, znakowane białko załadowano końcówką P10 do rurki dializacyjnej o szerokości 200 μm, która została uszczelniona cyjanoakrylanem (superglue) na jednym końcu z końcem włókna światłowodowego lub bez niego włożonym do środka.
W dziedzinie sensorów analitów prym wiodą sensory glukozy ze względu na dużą ilość badań nad sensorami glukozy w wyniku rozpowszechnienia cukrzycy, niemniej jednak szeroka gama biosensorów światłowodowych, wykorzystujących głównie enzymy, testy immunologiczne, kwasy nukleinowe, całe komórki lub materiały biomimetyczne i opierając się na różnych metodach wykrywania (fluorescencja, absorbancja, chemiluminescencja i rozpraszanie) oraz metodach przyczepiania (powlekanie, hydrożele lub membrany).
Jednak większość tych czujników polega na uwięzieniu białka w hydrożelach, ponieważ są one bardziej wytrzymałe i chronią białko bardziej niż zwykła powłoka lub membrana. Hydrożel to porowata usieciowana matryca polimerowa wypełniona wodą. Istnieje kilka rodzajów hydrożeli, które były używane do wychwytywania małych cząsteczek, takich jak barwniki, biomolekuły, takie jak enzymy lub całe komórki. W przypadku białka mogą działać albo poprzez fizyczne uwięzienie białka o porach mniejszych niż białka, albo poprzez chemiczne wiązanie białka z matrycą. W fizycznie uwięzionych żelach białko należy dodać, gdy żel jest usieciowany, więc stosowane warunki nie mogą uszkadzać białka, z wyjątkiem hydrożelu, który wymaga niewodnych rozpuszczalników lub ostrych chemikaliów, na przykład TEMED -katalizowany nadsiarczanem ( inicjacja rodników nadtlenkowych) akrylamid lub akrylan, który jest używany do SDS PAGE, ale nie do enkapsulacji białka.
Hydrożele były szeroko badane, głównie pod kątem uwięzienia małych cząsteczek w celu dostarczania leków, w tym przypadków, w których nanocząsteczki hydrożelu powoli uwalniają lek do docelowego miejsca. Hydrożele można klasyfikować według ich składników polimerowych, które mogą być naturalne (hialuronian, kwas alginowy, pektyna, karagen, siarczan chondroityny, dekstran i siarczan dekstranu, chitozan, polilizyna, kolagen, karboksymetylochityna, fibryna, agaroza, pullulan) lub syntetyczne ( PEG , PLA, PLGA, PCL, PHB, PVA , PNVP, P(HEMA), [ wymagane wyjaśnienie ] p(biscarboksy-fenoksy-fosfazen), p(siarczan GEMA) i inne) lub hybryda tych dwóch . Oprócz hydrożeli organicznych istnieją zol-żele, które są krzemianami z mostkami tlenowymi (lub tlenkiem tytanu), które polimeryzują w wodzie. Dodatkową klasyfikacją może być metoda polimeryzacji, która może być fizyczna (zamrażanie lub ogrzewanie) lub chemiczna (promieniowanie γ, tlen lub fotoindukowana polimeryzacja rodnikowa w przypadku akrylanów, winyli i akryloamidów).
Wszystkie różne hydrożele mają różne zalety i wady, takie jak biokompatybilność, stabilność białek, toksyczność lub żywotność; na przykład warunki żelowania zolu-żeli mogą uszkodzić białko, w wyniku czego można dodać kilka kopolimerów, takich jak chitozan (tworząc żele hybrydowe) lub alternatywne monomery, takie jak tetraetoksysilan modyfikowany glikolem, ponieważ jest bardziej biokompatybilny niż powszechnie stosowany tetraetoksysilan modyfikowany metoksy- lub etoksy.
Włókna z hydrożelem
Jeśli chodzi o biosensory oparte na światłowodach, zastosowano kilka hydrożeli, ale głównie polimery na bazie akrylanów i zol-żele, poprzez uwięzienie chemiczne lub fizyczne. W przypadku acetylocholinoesterazy, będącej celem wielu pestycydów, wykonano czujniki łączące chemicznie enzym z hydrożelem akrylanowym lub fizycznie zamykające enzym w zolżelu.
W laboratorium Loeba (Liao i współpracownicy) wykonano biosensor do glukozy z hydrożelem na bazie światłowodu i nazwano go Sencil. ten czujnik składał się z fotousieciowanego hydrożelu PEG modyfikowanego diakrylanem, zawierającego tetra-rodaminę (TRITC), znakowaną Freta i znakowany kropką kwantową apoenzym Concanavalin A. Ten czujnik był testowany pod kątem funkcjonalności tylko in vitro; przeprowadzono jednak pewne testy, aby sprawdzić zgodność włókna wszczepionego przezskórnie myszom. W szczególności monitorowano stan zapalny i mierzono energię potrzebną do usunięcia go siłą, co dowiodło, że włókno pokryte kolagenem wymagało większej siły niż usunięcie włosa o tej samej średnicy (200 μl).
Kolejny czujnik światłowodowy wykonano w laboratorium Singaram (Santa Cruz). Zastosowano hydrożel metakrylanu 2-hydroksyetylu jako rusztowanie, do którego przymocowano dwa barwniki, jeden fluorescencyjny barwnik anionowy i kationowy wygaszacz (konkretnie viologen) funkcjonalizowany kwasem boronowym, który przyjmuje ładunek ujemny po związaniu z glukozą, dzięki czemu ładunek netto cząsteczki jest neutralny i mniej przyciągany do fluoroforu, stąd modulowanie jego intensywności w oparciu o stężenie glukozy.
Większość hydrożeli jest przymocowana do włókna, jednym wyjątkiem jest czujnik światłowodowy wykonany przez grupę Itsubayashi do pomiaru glukozy u ryb (wskaźnik zdrowia), który wykorzystywał membranę dializacyjną jako wsparcie dla hydrożelu. Mówiąc dokładniej, opierał się na teście gaszenia tlenem-rutenem GOx, w którym białko mieszano z AWP (alkohol poliwinylowy funkcjonalizowany azydkiem, fotosieciowalny polimer) i sieciowano z membraną dializacyjną, którą owinięto wokół gotowej rutenowej sondy tlenowej (optyka oceaniczna) i włożony do igły o rozmiarze 18 z ośmioma otworami z boku (podobnie jak rejestrator). W takiej konfiguracji integralność białka nie ma wpływu na czujnik, chyba że poniżej pewnego stężenia. W konsekwencji zniszczenie lub niedostępność frakcji białka nie jest problematyczna, w przeciwieństwie do Freta lub wrażliwego na środowisko. Jednak szybkość odpowiedzi tego czujnika jest niska i wymaga zastosowania przewidywania matematycznego do pomiaru.
Alternatywne zastosowanie kwasu boronowego w hydrożelach obserwuje się w Stokke w Norwegii, gdzie pęcznienie żelu akryloamidowego funkcjonalizowanego boronianem w wyniku zmiany ładunku po związaniu glukozy jest mierzone za pomocą interferometru Fabry'ego-Pérota na drugim końcu włókna (zauważ, że to a inna metoda niż fluorescencja i opiera się na rozpraszaniu).
Wyjątkiem od stosowania transdermalnego umieszczania światłowodu jest wspomniane wcześniej włókno z grupy Ingo Klimanta (wygaszanie rutenu przez tlen uwalniany przez GOx katalizowane glukozą): Czujnik w rzeczywistości został skonstruowany poprzez funkcjonalizację gotowego czujnika tlenu z oksydazą glukozową i wprowadzeniem go do urządzenia wykrywającego glukozę dla czujników amperometrycznych, w szczególności cewnika do mikrodializy CMA 60 wszczepionego przezskórnie i czujnika podłączonego do jego rurki tygonowej. Ten czujnik został przetestowany na ochotnikach i wykazał wyniki porównywalne z obecnymi systemami amperometrycznymi. Użycie światłowodu było podyktowane jego wcześniejszą dostępnością w porównaniu z soczewkami pokrytymi rutenem, które dawałyby takie same wyniki, więc to podejście należy umieścić w odrębnej kategorii obok włókien przezskórnych i inteligentnych tatuaży. Jednak celem grupy jest stworzenie wrażliwych na glukozę nanocząstek, które będą badane za pomocą transdermalnego włókna światłowodowego i kontrolowane magnetycznie. W rezultacie grupa udoskonala sondę wykrywającą tlen, badając nowe materiały fosforyzujące wrażliwe na tlen, formułowanie nanocząstek i tworzenie nanocząstek magnetycznych.
Zobacz też
Notatki
- ^ Pomimo kontrowersji wokół Homme Hellinga (patrz Hellinga Controversy Expands ) wyniki te nie są badane.
- ^ Pomimo obecności tego samego mutanta, artykuł nie cytuje, ale uzyskał mutanta, badając strukturę drugorzędową.