Aekworyna

Aekworyna 1
Diagram wstęgi ekworyny z PDB 1ej3 z grupą prostetyczną koelenterazyną w kolorze niebieskim
Identyfikatory
Organizm	Aequorea victoria (Meduza)
Symbol	Nie dotyczy
UniProt	P07164
Inne dane
numer WE	1.13.12.5
Szukaj Struktury Model szwajcarski Domeny InterPro

Aequorin to fotoproteina aktywowana wapniem, wyizolowana z hydrozoanu Aequorea victoria . Jego bioluminescencję badano dziesiątki lat przed wyizolowaniem białka ze zwierzęcia przez Osamu Shimomurę w 1962 r. U zwierzęcia białko występuje razem z białkiem zielonej fluorescencji, wytwarzając zielone światło poprzez rezonansowy transfer energii , podczas gdy sama ekworyna generuje niebieskie światło.

Dyskusje na temat „DNA meduzy”, które może powodować „świecące” zwierzęta, często odnoszą się do zwierząt transgenicznych , które wyrażają zielone białko fluorescencyjne, a nie aekworynę, chociaż oba pierwotnie pochodzą od tego samego zwierzęcia.

Apoaekworyna, białkowa część aekworyny, jest składnikiem suplementu diety Prevagen. Amerykańska Federalna Komisja Handlu (FTC) oskarżyła producenta o fałszywą reklamę jego twierdzeń o poprawie pamięci.

Odkrycie

Prace nad ekworyną rozpoczął E. Newton Harvey w 1921 r. Chociaż Harvey nie był w stanie zademonstrować klasycznej reakcji lucyferazy z lucyferyną , wykazał, że woda może wytwarzać światło z wysuszonych fotocytów i że światło może być wytwarzane nawet przy braku tlenu. Później Osamu Shimomura rozpoczął pracę nad bioluminescencją Aequorea w 1961 roku. Wymagało to żmudnego zbierania dziesiątek tysięcy meduz z doków w Friday Harbor w stanie Waszyngton . Ustalono, że światło można wytwarzać z ekstraktów z wodą morską, a dokładniej z wapniem . Zauważono również, że podczas ekstrakcji zwierzę wytwarza zielone światło dzięki obecności zielonego białka fluorescencyjnego , które zmienia natywne niebieskie światło aekworyny na zielone.

Podczas gdy jego praca skupiała się głównie na bioluminescencji, Shimomura i dwóch innych, Martin Chalfie i Roger Tsien , otrzymali w 2008 roku Nagrodę Nobla za pracę nad zielonymi białkami fluorescencyjnymi .

Struktura

Aekworyna jest holoproteiną złożoną z dwóch odrębnych jednostek, apoproteiny zwanej apoaekworyną , która ma przybliżoną masę cząsteczkową 21 kDa , oraz grupy prostetycznej koelenterazyny , lucyferyny. Oznacza to, że apoaekworyna jest enzymem wytwarzanym w fotocytach zwierzęcia, a koelenterazyna jest substratem, którego utlenianie katalizuje enzym. Kiedy koelenterazyna jest związana, nazywa się ją aekworyną. Warto zauważyć, że białko zawiera trzy dłoni EF , które działają jako miejsca wiązania jonów Ca2 ⁺ . Białko należy do nadrodziny białek wiążących wapń, która obejmuje około 66 podrodzin.

Struktura krystaliczna wykazała, że ​​ekworyna wiąże koelenterazynę i tlen w postaci nadtlenku , 2-wodoronadtlenku koelenterazyny. Miejsce wiązania pierwszych dwóch atomów wapnia wykazuje 20-krotnie większe powinowactwo do wapnia niż miejsce trzecie. Jednak wcześniejsze twierdzenia, że ​​​​tylko dwie ręce EF wiążą wapń, zostały zakwestionowane, gdy późniejsze struktury wskazywały, że wszystkie trzy miejsca rzeczywiście mogą wiązać wapń. Zatem miareczkowania pokazują, że wszystkie trzy miejsca wiązania wapnia są aktywne, ale tylko dwa jony są potrzebne do wywołania reakcji enzymatycznej.

Inne badania wykazały obecność wewnętrznego wiązania cysteiny , które utrzymuje strukturę ekworyny. Wyjaśniło to również potrzebę stosowania odczynnika tiolowego , takiego jak beta-merkaptoetanol, do regeneracji białka, ponieważ takie odczynniki osłabiają wiązania sulfhydrylowe między resztami cysteiny , przyspieszając regenerację ekworyny.

Charakterystyka chemiczna ekworyny wskazuje, że białko jest nieco odporne na surowe traktowanie. Ekworyna jest odporna na ciepło. Trzymane w temperaturze 95°C przez 2 minuty białko straciło tylko 25% aktywności. Denaturanty takie jak 6-M mocznik lub 4-M chlorowodorek guanidyny nie niszczyły białka.

Genetyka

Aekworyna jest prawdopodobnie zakodowana w genomie Aequorea. Co najmniej cztery kopie genu odzyskano jako cDNA od zwierzęcia. Ponieważ genom nie został zsekwencjonowany, nie jest jasne, czy warianty cDNA mogą odpowiadać za wszystkie izoformy białka.

Mechanizm akcji

Wczesne badania bioluminescencji Aequorea przeprowadzone przez E. Newtona Harveya wykazały, że bioluminescencja pojawia się jako pierścień wokół dzwonka i występuje nawet przy braku powietrza . Było to niezwykłe, ponieważ większość reakcji bioluminescencyjnych wymaga tlenu i doprowadziło do pomysłu, że zwierzęta w jakiś sposób magazynują tlen. Później odkryto, że apoproteina może stabilnie wiązać 2-wodoronadtlenek koelenterazyny, a do regeneracji tej aktywnej formy ekworyny potrzebny jest tlen. Jednak w obecności wapnia białko przechodzi zmianę konformacyjną i przekształca swoją grupę prostetyczną, koelenterazyno-2-wodoronadtlenek, w wzbudzony koelenteramid i CO2 _. Gdy wzbudzony koelenteramid relaksuje się do stanu podstawowego, emitowane jest światło niebieskie ( długość fali 465 nm). Przed wymianą koelenteramidu całe białko nadal jest fluorescencyjnie niebieskie. ze względu na związek między bioluminescencją a fluorescencją ta właściwość była ostatecznie ważna w odkryciu koelenterazyny lucyferyny .

Aplikacje

Ponieważ emitowane światło można łatwo wykryć za pomocą luminometru , ekworyna stała się użytecznym narzędziem w biologii molekularnej do pomiaru poziomu wewnątrzkomórkowego Ca ²⁺ . Wczesne pomyślne oczyszczenie ekworyny doprowadziło do pierwszych eksperymentów polegających na wstrzyknięciu białka do tkanek żywych zwierząt w celu wizualizacji fizjologicznego uwalniania wapnia we włóknach mięśniowych pąkli. Od tego czasu białko było szeroko stosowane w wielu modelowych układach biologicznych , w tym u danio pręgowanego , szczurów , myszy i w hodowlach komórkowych .

genu ekworyny mogą skutecznie syntetyzować apoaekworynę; jednakże rekombinowana ekspresja daje tylko apoproteinę . Dlatego konieczne jest dodanie koelenterazyny do pożywki hodowlanej komórek w celu uzyskania funkcjonalnego białka, a tym samym wykorzystanie jego emisji światła niebieskiego do pomiaru stężenia Ca ^{2+ .} Koelenterazyna jest cząsteczką hydrofobową i dlatego jest łatwo wchłaniana przez ściany komórkowe roślin i grzybów , jak również błonę plazmatyczną wyższych eukariotów, dzięki czemu ekworyna jest odpowiednia jako reporter Ca ²⁺ w komórkach roślin, grzybów i ssaków.

Aequorin ma szereg zalet w stosunku do innych wskaźników Ca ²⁺ . Ponieważ białko jest duże, ma niski wskaźnik wycieku z komórek w porównaniu z lipofilowymi , takimi jak DiI . Brakuje mu zjawiska kompartmentalizacji wewnątrzkomórkowej lub sekwestracji, co często obserwuje się w przypadku barwników wrażliwych na napięcie , i nie zakłóca funkcji komórek ani rozwoju zarodka. Ponadto światło emitowane przez utlenianie koelenterazyny nie zależy od żadnego wzbudzenia optycznego, dzięki czemu wyeliminowane są problemy z autofluorescencją. Podstawowym ograniczeniem ekworyny jest to, że koelenterazyna z grupy prostetycznej jest nieodwracalnie zużywana w celu wytworzenia światła i wymaga ciągłego dodawania koelenterazyny do pożywki. Takie problemy doprowadziły do ​​opracowania innych genetycznie zakodowanych czujników wapnia, w tym czujnika kameleon opartego na kalmodulinie , opracowanego przez Rogera Tsiena i czujnika opartego na troponinie , TN-XXL , opracowanego przez Olivera Griesbecka.

Wyzwania marketingowe i prawne

Apoaequorin jest składnikiem „Prevagen”, który jest sprzedawany przez Quincy Bioscience jako suplement pamięci. W 2017 roku amerykańska Federalna Komisja Handlu (FTC) oskarżyła producenta o fałszywą reklamę , że produkt poprawia pamięć, zapewnia korzyści poznawcze i „wykazano klinicznie”, że działa. Według FTC „marketerzy Prevagen żerowali na obawach starszych konsumentów doświadczających związanej z wiekiem utraty pamięci ”. Quincy powiedział, że będzie walczył z zarzutami.

Przed pozwem badanie kliniczne przeprowadzone przez naukowców zatrudnionych przez Quincy Bioscience „nie wykazało żadnych ogólnych korzyści w porównaniu z placebo w zakresie głównych punktów końcowych obejmujących pamięć i funkcje poznawcze”, podczas gdy reklama firmy błędnie cytowała kilka kwestionowanych analiz podgrup, które wykazały niewielką poprawę .

Pozew ( Spath i in. przeciwko Quincy Bioscience Holding Company, Inc. i in. , sprawa nr 18-cv-12416, D. NJ.) został oddalony w sądzie rejonowym, ale odwołanie ma na celu uchylenie zwolnienia został złożony. Pozew został połączony z innym pozwem przeciwko Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff przeciwko Quincy Bioscience (sprawa nr 17-cv-784, D. NJ), który był głównym przypadkiem.

21 lutego 2019 roku Sąd Apelacyjny Stanów Zjednoczonych dla Drugiego Okręgu orzekł, że FTC i stan Nowy Jork mogą wszcząć pozew przeciwko Quincy Bioscience w związku z jego twierdzeniami, że Prevagen może poprawić pamięć. Nakaz wydano niecałe dwa tygodnie po tym, jak strony argumentowały sprawę przed trzyosobowym składem sędziowskim okręgu, w którym prawnicy firmy przyznali, że nie „kwestionują, że jeśli spojrzy się na wszystkie 211 osób, które ukończyły badanie, nie było statystycznie istotnego różnica". Sąd zdecydowanie odrzucił zarzuty prawników firmy, że FTC prowadziła swoje działania z powodów politycznych.

W dniu 23 marca 2020 r. sędzia pokoju federalnego w Sądzie Okręgowym Stanów Zjednoczonych dla Południowego Dystryktu Florydy przedstawił raport i zalecenia potwierdzające ogólnokrajowy pozew zbiorowy dla grupy konsumentów, którzy kupili Prevagen w ciągu ostatnich czterech lat. Termin rozprawy w tej sprawie wyznaczono na październik 2020 r.

Dr Harriet Hall , pisząca dla Science-Based Medicine , zauważa, że ​​badanie sponsorowane przez Quincy (znane jako „Madison Memory Study”) było negatywne, ale firma wykorzystała hakowanie p-hack , aby uzyskać korzystne wyniki. Zauważa, że ​​wszystkie cytowane badania bezpieczeństwa to badania na szczurach, a ich twierdzenie, że apoaequorin przekracza barierę krew-mózg , opiera się wyłącznie na badaniach na psach. Amerykańskie Stowarzyszenie Farmaceutów ostrzega, że ​​Apoaequorin „jest mało prawdopodobne, aby został wchłonięty w znacznym stopniu; zamiast tego rozkłada się na aminokwasy”.

Linki zewnętrzne

• Wpis Swiss-Prot Aequorin zarchiwizowany 2007-03-23 ​​w Wayback Machine