Szeregowa skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem czołowym
Szeregowa skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem czołowym to metoda generowania trójwymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości z małych próbek. Technika została opracowana dla tkanki mózgowej, ale ma szerokie zastosowanie do wszelkich próbek biologicznych. Skaningowy mikroskop elektronowy szeregowy składa się z ultramikrotomu zamontowanego wewnątrz komory próżniowej skaningowego mikroskopu elektronowego . Próbki są przygotowywane metodami podobnymi do tych stosowanych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej ( TEM ), zwykle przez utrwalenie próbki aldehydem, barwienie metalami ciężkimi, takimi jak osm i uran, a następnie zatapianie w żywicy epoksydowej. Powierzchnia bloku próbki zatopionej w żywicy jest obrazowana przez wykrywanie wstecznie rozproszonych elektronów. Po obrazowaniu ultramikrotom jest używany do wycinania cienkiego skrawka (zwykle około 30 nm) z powierzchni bloku. Po wycięciu przekroju blok próbki jest podnoszony z powrotem do płaszczyzny ogniskowej i ponownie obrazowany. Ta sekwencja obrazowania próbki, wycinania przekrojów i podnoszenia bloków może w sposób zautomatyzowany uzyskać wiele tysięcy obrazów w idealnym ustawieniu. Praktyczna skaningowa mikroskopia elektronowa z blokami szeregowymi została wynaleziona w 2004 roku przez Winfrieda Denka w Max-Planck-Institute w Heidelbergu i jest dostępny na rynku od Gatan Inc., Thermo Fisher Scientific (VolumeScope) i ConnectomX.
Aplikacje
Jednym z pierwszych zastosowań seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokami twarzowymi była analiza połączeń aksonów w mózgu. Rozdzielczość jest wystarczająca do prześledzenia nawet najcieńszych aksonów i identyfikacji synaps. Do tej pory [ kiedy? ] , seryjne obrazowanie twarzy bloków przyczyniło się do wielu dziedzin, takich jak biologia rozwoju, biologia roślin, badania nad rakiem, badanie chorób neurodegeneracyjnych itp. Technika ta może generować niezwykle duże zbiory danych i opracowywać algorytmy do automatycznej segmentacji generowanych bardzo dużych zbiorów danych nadal stanowi wyzwanie. Jednak obecnie w tej dziedzinie wykonuje się wiele prac. Projekt EyeWire wykorzystuje ludzkie obliczenia w grze do śledzenia neuronów za pomocą obrazów objętości siatkówki uzyskanych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z blokami seryjnymi.
Wiele różnych próbek można przygotować do seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej blokowej, a ultramikrotom jest w stanie ciąć wiele materiałów, dlatego ta technika ma szersze zastosowanie. Zaczyna znajdować zastosowania w wielu innych dziedzinach, od biologii komórki i rozwoju po materiałoznawstwo.
Zalety i wady
Wadą napotkaną w metodzie SBEM jest to, że grubość warstwy, którą można usunąć za pomocą ultramikrotomu, jest ograniczona (~ 25 nm), a zatem rozdzielczość w kierunku głębokości jest ograniczona. Zaletą techniki SBEM jest to, że preparat jest nieruchomy, co poprawia wyrównanie w stosach obrazów. Kolejną zaletą techniki SBEM jest możliwość pozyskiwania dużych zbiorów danych o wysokim poziomie szczegółowości. Ponieważ cięcie ultramikrotomem jest niezwykle szybkie (w porównaniu z procesem frezowania w FIB-SEM), może naświetlać duży obszar materiału (kierunek x i y) przy każdym cięciu. Dodatkowo, dzięki szybkiemu cięciu, możemy w krótkim czasie uzyskać wiele obrazów w kierunku Z.
Zobacz też
Linki zewnętrzne
- [1] Oryginalna publikacja w PLOS Biology
- [2] Widok 3 Gatana
- [3] Baza danych skoncentrowana na komórkach, zbiory danych SBEM