Mikrotom

Aby zapoznać się z rodzajem ćmy, zobacz Mikrotom (ćma) .

Mikrotom ( z greckiego mikros , co oznacza „mały” i temnein , co oznacza „cięcie”) jest narzędziem tnącym używanym do produkcji bardzo cienkich plastrów materiału zwanych sekcjami , przy czym proces ten nazywany jest mikrosekcją . Ważne w nauce mikrotomy są wykorzystywane w mikroskopii do przygotowania próbek do obserwacji w świetle przechodzącym lub promieniowaniu elektronowym .

Mikrotomy wykorzystują stalowe , szklane lub diamentowe ostrza w zależności od krojonej próbki i pożądanej grubości ciętych skrawków. Ostrza stalowe służą do przygotowania histologicznych tkanek zwierzęcych lub roślinnych do mikroskopii świetlnej . Szklane noże są używane do krojenia skrawków do mikroskopii świetlnej oraz do krojenia bardzo cienkich skrawków do mikroskopii elektronowej . Noże diamentowe klasy przemysłowej służą do krojenia twardych materiałów, takich jak kości , zęby i twarda materia roślinna zarówno do mikroskopii świetlnej, jak i mikroskopii elektronowej. Noże diamentowe o jakości klejnotów są również używane do krojenia cienkich skrawków do mikroskopii elektronowej .

Mikrotomia to metoda preparacji cienkich skrawków materiałów takich jak kości, minerały i zęby, stanowiąca alternatywę dla elektropolerowania i frezowania jonowego . Skrawki mikrotomu mogą być wystarczająco cienkie, aby przeciąć ludzki włos w poprzek, o grubości od 50 nm do 100 μm .

Historia

Schemat mikrotomu narysowany przez Cummingsa w 1770 roku.

W początkach rozwoju mikroskopów świetlnych skrawki roślin i zwierząt przygotowywano ręcznie za pomocą żyletek. Stwierdzono, że dla obserwacji struktury obserwowanego preparatu ważne jest wykonanie czystych, powtarzalnych cięć rzędu 100 μm, przez które może przechodzić światło. Pozwoliło to na obserwację próbek za pomocą mikroskopów świetlnych w trybie transmisyjnym.

Jedno z pierwszych urządzeń do przygotowywania takich nacięć zostało wynalezione w 1770 r. przez George'a Adamsa Jr. (1750–1795), a następnie rozwinięte przez Alexandra Cummingsa . Urządzenie było obsługiwane ręcznie, a próbka była trzymana w cylindrze i skrawki tworzone od góry próbki za pomocą ręcznej korby.

W 1835 roku Andrew Prichard opracował model oparty na stole, który pozwolił na wyizolowanie wibracji poprzez przymocowanie urządzenia do stołu, oddzielając operatora od noża.

Czasami przypisuje się wynalezienie mikrotomu anatomowi Wilhelmowi His seniorowi (1865), w swoim Beschreibung eines Mikrotoms (niem. Opis mikrotomu ) Wilhelm napisał:

Urządzenie umożliwiło precyzję pracy, dzięki której mogę uzyskać sekcje, których nie jestem w stanie stworzyć ręcznie. Mianowicie umożliwiło to uzyskanie nieprzerwanych przekrojów obiektów w trakcie badań.

Inne źródła dalej przypisują rozwój czeskiemu fizjologowi Janowi Evangelista Purkyně . Kilka źródeł opisuje model Purkyne'a jako pierwszy w praktycznym zastosowaniu.

Niejasności w pochodzeniu mikrotomu wynikają z faktu, że pierwsze mikrotomy były po prostu urządzeniami tnącymi, a faza rozwoju wczesnych urządzeń jest szeroko nieudokumentowana.

Pod koniec XIX wieku opracowanie bardzo cienkich i konsekwentnie cienkich próbek za pomocą mikrotomii wraz z selektywnym barwieniem ważnych składników lub cząsteczek komórek umożliwiło wizualizację szczegółów mikroskopowych.

Obecnie większość mikrotomów to konstrukcja bloku noża z wymiennym nożem, uchwytem preparatu i mechanizmem przesuwania. W większości urządzeń cięcie próbki rozpoczyna się od przesunięcia próbki po nożu, gdzie mechanizm przesuwania automatycznie przesuwa się do przodu tak, że można wykonać kolejne cięcie dla wybranej grubości. Grubość cięcia jest kontrolowana przez mechanizm regulacji, co pozwala na precyzyjną kontrolę.

Aplikacje

Mikrotom (C. Reichert, Wiedeń, 1905–1915).

Najczęstsze zastosowania mikrotomów to:

• Tradycyjna technika histologiczna : tkanki są utrwalane, odwadniane, oczyszczane i zatapiane w stopionej parafinie , która po schłodzeniu tworzy stały blok. Tkanka jest następnie cięta w mikrotomie na grubość w zakresie od 2 do 50 μm. Stamtąd tkankę można umieścić na szkiełku mikroskopowym, zabarwić odpowiednim wodnym barwnikiem (barwnikami) po usunięciu parafiny i zbadać pod mikroskopem świetlnym.
• Procedura cięcia zamrożonego : tkanki bogate w wodę są utwardzane przez zamrażanie i cięcie w stanie zamrożonym za pomocą mikrotomu zamrażającego lub mikrotomu- kriostatu ; skrawki barwi się i bada pod mikroskopem świetlnym. Ta technika jest znacznie szybsza niż tradycyjna histologia (5 minut w porównaniu do 16 godzin) i jest stosowana w połączeniu z procedurami medycznymi w celu uzyskania szybkiej diagnozy. Krioskrawki mogą być również stosowane w immunohistochemii , ponieważ zamrażanie tkanki zatrzymuje degradację tkanki szybciej niż użycie utrwalacza i nie zmienia ani nie maskuje tak bardzo jej składu chemicznego.
• mikroskopii elektronowej : po zatopieniu tkanek w żywicy epoksydowej do cięcia bardzo cienkich skrawków (zwykle od 60 do 100 nanometrów) używa się mikrotomu wyposażonego w nóż diamentowy klasy szklanej lub diamentowej. Skrawki barwi się wodnym roztworem odpowiedniej soli metalu ciężkiego i bada pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym . Ten instrument jest często nazywany ultramikrotomem . Ultramikrotom jest również używany z nożem do szkła lub przemysłowym nożem diamentowym do cięcia przekrojów pomiarowych przed cięciem cienkich skrawków. Te skrawki badawcze mają na ogół grubość od 0,5 do 1 μm i są montowane na szkiełku podstawowym i barwione w celu zlokalizowania interesujących obszarów pod mikroskopem świetlnym przed cienkim skrawkiem do TEM. Cienkie cięcie dla TEM jest często wykonywane za pomocą diamentowego noża o jakości klejnotów. Uzupełniając tradycyjne techniki TEM, ultramikrotomy są coraz częściej montowane wewnątrz komory SEM, dzięki czemu można zobrazować powierzchnię czoła bloku, a następnie usunąć za pomocą mikrotomu, aby odsłonić następną powierzchnię do obrazowania. Ta technika nazywa się Szeregowa skaningowa mikroskopia elektronowa z blokiem twarzy (SBFSEM).
• Technika mikrotomii botanicznej: twarde materiały, takie jak drewno, kość i skóra, wymagają mikrotomu saneczkowego . Te mikrotomy mają cięższe ostrza i nie mogą ciąć tak cienko, jak zwykły mikrotom.
• Spektroskopia (zwłaszcza FTIR lub spektroskopia w podczerwieni ) Technika: potrzebne są cienkie skrawki polimeru, aby wiązka podczerwieni mogła przeniknąć przez badaną próbkę. Normalne jest cięcie próbek do grubości od 20 do 100 μm. Aby uzyskać bardziej szczegółową analizę znacznie mniejszych obszarów w cienkim przekroju, do kontroli próbek można zastosować mikroskopię FTIR.

Niedawnym osiągnięciem jest mikrotom laserowy , który tnie docelową próbkę laserem femtosekundowym zamiast noża mechanicznego. Metoda ta jest bezkontaktowa i nie wymaga technik przygotowania próbki. Mikrotom laserowy ma możliwość przecięcia prawie każdej tkanki w stanie natywnym. W zależności od obrabianego materiału możliwe są grubości plastrów od 10 do 100 μm.

Odstępy między sekcjami można podzielić głównie na:

• Cięcie seryjne: uzyskiwanie ciągłej wstęgi skrawków z bloku parafinowego i wykorzystywanie wszystkich do szkiełek.
• Sekcje schodkowe: zbierane na określonych głębokościach w bloku.

typy

Sanki

Sanki mikrotom

Mikrotom saneczkowy to urządzenie, w którym próbka jest umieszczana w stałym uchwycie (wahadłowiec), który następnie porusza się do tyłu i do przodu po nożu. Nowoczesne mikrotomy sań mają sanki umieszczone na łożysku liniowym, co pozwala mikrotomowi na łatwe cięcie wielu grubych skrawków. Regulując kąty między próbką a nożem mikrotomu, można zmniejszyć nacisk wywierany na próbkę podczas cięcia. Typowe zastosowania tego projektu mikrotomu to przygotowanie dużych próbek, takich jak te zatopione w parafinie do preparatów biologicznych. Typowa grubość cięcia osiągalna na mikrotomie sań wynosi od 1 do 60 μm.

Obrotowy

Mikrotom obrotowy starszej konstrukcji

Ten instrument jest typowym projektem mikrotomu. To urządzenie działa z etapowym działaniem obrotowym, tak że rzeczywiste cięcie jest częścią ruchu obrotowego. W mikrotomie obrotowym nóż jest zwykle zamocowany w pozycji pionowej.

Zasada ruchu próbki do wykonania nacięcia na mikrotomie obrotowym

Na rysunku po lewej wyjaśniono zasadę cięcia. Poprzez ruch uchwytu próbki, próbka jest przecinana przez nóż z pozycji 1 do pozycji 2, w której świeży skrawek pozostaje na nożu. W najwyższym punkcie ruchu obrotowego uchwyt próbki jest przesuwany o taką samą grubość jak przekrój, który ma zostać wykonany, umożliwiając wykonanie kolejnego przekroju.

Koło zamachowe w wielu mikrotomach można obsługiwać ręcznie. Ma to tę zaletę, że można wykonać czyste cięcie, ponieważ stosunkowo duża masa koła zamachowego zapobiega zatrzymaniu próbki podczas cięcia próbki. Koło zamachowe w nowszych modelach jest często zintegrowane z obudową mikrotomu. Typowa grubość cięcia dla mikrotomu obrotowego wynosi od 1 do 60 μm. W przypadku twardych materiałów, takich jak próbka zatopiona w żywicy syntetycznej, taka konstrukcja mikrotomu umożliwia uzyskanie dobrych „półcienkich” przekrojów o grubości zaledwie 0,5 μm.

kriomikrotom

Zobacz także: Procedura sekcji zamrożonej

Kriomikrotom

Do cięcia zamrożonych próbek wiele mikrotomów obrotowych można przystosować do cięcia w komorze ciekłego azotu, w tak zwanej konfiguracji kriomikrotomu. Obniżona temperatura pozwala na zwiększenie twardości próbki, na przykład poprzez przejście zeszklenia, co pozwala na przygotowanie półcienkich próbek. Jednak temperatura próbki i temperatura noża muszą być kontrolowane, aby zoptymalizować wynikową grubość próbki.

Ultramikrotom

Wstęga ultracienkich skrawków przygotowana przez ultramikrotomię w temperaturze pokojowej, unosząca się na wodzie w łódce diamentowego noża używanego do cięcia skrawków. Ostrze noża to krawędź na górnym końcu koryta z wodą.

Ultramikrotom jest głównym narzędziem ultramikrotomii . Pozwala na preparację ekstremalnie cienkich skrawków, przy czym urządzenie działa tak samo jak mikrotom rotacyjny, ale z bardzo wąskimi tolerancjami konstrukcji mechanicznej. W wyniku starannej konstrukcji mechanicznej liniowa rozszerzalność cieplna mocowania jest wykorzystywana do zapewnienia bardzo dokładnej kontroli grubości.

Te niezwykle cienkie nacięcia są ważne w przypadku transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) i seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM), a czasami są również ważne w mikroskopii świetlno-optycznej. Typowa grubość tych nacięć wynosi od 40 do 100 nm dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej i często od 30 do 50 nm dla SBFSEM. Grubsze skrawki o grubości do 500 nm są również pobierane do specjalistycznych zastosowań TEM lub do skrawków do badań mikroskopii świetlnej w celu wybrania obszaru dla końcowych cienkich skrawków. Noże diamentowe (najlepiej) i szklane noże są używane z ultramikrotomami. Aby zebrać skrawki, są one unoszone na powierzchni cieczy podczas cięcia i są ostrożnie zbierane na kratkach odpowiednich do oglądania próbek TEM. Grubość przekroju można oszacować na podstawie interferencyjnych cienkowarstwowych odbitego światła, które są widoczne w wyniku wyjątkowo małej grubości próbki.

Wibracja

Główny artykuł: Wibrator

Wibrujący mikrotom działa na zasadzie cięcia za pomocą wibrującego ostrza, co pozwala na wykonanie cięcia z mniejszym naciskiem niż byłoby to wymagane w przypadku ostrza stacjonarnego. Mikrotom wibracyjny jest zwykle używany do trudnych próbek biologicznych. Grubość cięcia wynosi zwykle około 30–500 μm dla żywej tkanki i 10–500 μm dla tkanki utrwalonej.

Odmianą mikrotomu wibracyjnego jest mikrotom Compresstome. Compresstome wykorzystuje strzykawkę z preparatem lub rurkę przypominającą szminkę do trzymania tkanki. Próbka tkanki jest całkowicie zanurzona w agarozie ( polisacharyd ), a tkanka jest powoli i delikatnie wyciskana z rurki, aby wibrujące ostrze mogło ją przeciąć. Urządzenie działa w następujący sposób: koniec probówki z preparatem, z której wyłania się tkanka, jest nieco węższy od końca ładującego, co pozwala na delikatne „ściskanie” tkanki wychodzącej z tuby. Lekka kompresja zapobiega powstawaniu artefaktów ścinania, nierównego cięcia i wibracji. Należy pamiętać, że technologia kompresji nie uszkadza ani nie wpływa na wycinaną tkankę.

Mikrotom Compresstome ma kilka zalet: 1) zatopienie w agarozie zapewnia stabilność całej próbki ze wszystkich stron, co zapobiega nierównomiernemu cięciu lub cięciu tkanki; 2) technologia kompresji delikatnie ściska tkankę w celu równomiernego cięcia, dzięki czemu ostrze nie naciska na tkankę; 3) szybsze cięcie niż większość mikrotomów wibracyjnych; oraz 4) dobrze tnie tkanki starszych lub bardziej dojrzałych zwierząt, aby zapewnić zdrowsze tkanki.

Piła

Mikrotom piły jest szczególnie przydatny do twardych materiałów, takich jak zęby lub kości. Mikrotom tego typu ma zagłębioną obrotową piłę, która przecina próbkę. Minimalna grubość cięcia wynosi około 30 μm i może być wykonana dla stosunkowo dużych próbek.

Laser

Zobacz też: Mikrotom laserowy

Schemat koncepcyjny działania mikrotomu laserowego

Mikrotom laserowy to przyrząd do bezkontaktowego krojenia. Nie jest wymagane wcześniejsze przygotowanie próbki poprzez zatapianie, zamrażanie lub utrwalanie chemiczne , co minimalizuje artefakty wynikające z metod przygotowania. Alternatywnie ten projekt mikrotomu może być również używany do bardzo twardych materiałów, takich jak kości lub zęby, a także do niektórych materiałów ceramicznych. W zależności od właściwości materiału próbki, osiągalna grubość wynosi od 10 do 100 μm.

Urządzenie działa w oparciu o działanie tnące lasera na podczerwień. Ponieważ laser emituje promieniowanie w bliskiej podczerwieni, w tym reżimie długości fali laser może oddziaływać z materiałami biologicznymi. Poprzez ostre ogniskowanie sondy w próbce, ognisko o bardzo dużej intensywności, do TW /cm ² , może być osiągnięte. Poprzez nieliniową interakcję penetracji optycznej w obszarze ogniska następuje separacja materiału w procesie znanym jako fotodysrupcja. Ograniczając czas trwania impulsu laserowego do zakresu femtosekund, energia wydatkowana w obszarze docelowym jest precyzyjnie kontrolowana, ograniczając w ten sposób strefę interakcji cięcia do poniżej mikrometra. Poza tą strefą czas przyłożenia ultrakrótkiej wiązki powoduje minimalne lub żadne uszkodzenia termiczne pozostałej części próbki.

Promieniowanie laserowe jest kierowane na szybko skanujący system optyczny oparty na zwierciadle, który umożliwia trójwymiarowe pozycjonowanie skrzyżowania wiązki, jednocześnie umożliwiając przejście wiązki do pożądanego obszaru zainteresowania. Połączenie dużej mocy z dużą szybkością rastra pozwala skanerowi na cięcie dużych obszarów próbki w krótkim czasie. W mikrotomie laserowym możliwa jest również mikrodysekcja laserowa wewnętrznych obszarów tkanek, struktur komórkowych i innych rodzajów drobnych cech.

Noże

Diamentowe ostrze noża używane do cięcia ultracienkich skrawków (zwykle od 70 do 350 nm) do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Krawędź tnąca jednorazowego ostrza do mikrotomu pod mikroskopem.

Wybór profilu ostrza noża do mikrotomu zależy od materiału i przygotowania próbek, a także od końcowych wymagań dotyczących próbki (np. grubość i jakość cięcia).

Typy projektów i krojów

Profile noży mikrotomowych.

Ogólnie noże charakteryzują się profilem ostrza noża, który mieści się w kategoriach płaskich konstrukcji wklęsłych, w kształcie klina lub w kształcie dłuta.

Płaskie wklęsłe noże do mikrotomu są niezwykle ostre, ale są również bardzo delikatne i dlatego są używane tylko do bardzo miękkich próbek. Noże o profilu klinowym są nieco bardziej stabilne i znajdują zastosowanie w średnio twardych materiałach, takich jak cięcie próbek epoksydowych lub kriogenicznych. Wreszcie profil dłuta z tępą krawędzią zwiększa stabilność noża, jednocześnie wymagając znacznie większej siły, aby wykonać cięcie.

Do ultramikrotomów wymagane są noże szklane i diamentowe, dlatego szerokość cięcia ostrza jest rzędu kilku milimetrów, a zatem jest znacznie mniejsza niż w przypadku klasycznych noży do mikrotomów. Noże szklane są zwykle wytwarzane przez łamanie szklanych prętów przy użyciu specjalnych urządzeń do szczelinowania „do robienia noży”. Noże szklane mogą być używane do wstępnego przygotowania próbek, nawet jeśli noże diamentowe mogą być używane do końcowego cięcia. Szklane noże mają zwykle małe koryta wykonane z plastikowej taśmy, które są wypełnione wodą, aby umożliwić unoszenie się próbki do późniejszego pobrania. Tarcze diamentowe mogą być wbudowane w taką istniejącą rynnę, pozwalając na ten sam sposób zbierania.

Sekcje

Przed cięciem mikrotomem materiały biologiczne są zwykle umieszczane w sztywniejszym utrwalaczu w procesie znanym jako osadzanie. Osiąga się to poprzez napływ ciekłej substancji wokół próbki, takiej jak parafina (wosk) lub żywica epoksydowa, która jest umieszczana w formie, a następnie utwardzana w celu wytworzenia „bloku”, który można łatwo przeciąć.

Deklinacja to kąt kontaktu między pionem próbki a ostrzem noża. Jeśli ostrze noża jest ustawione pod kątem prostym (odchylenie = 90), cięcie jest wykonywane bezpośrednio w trybie opartym na nacisku, a zatem siły są proporcjonalnie większe. Jeśli jednak nóż jest przechylony, względny ruch noża jest coraz bardziej równoległy do ​​ruchu próbki, co pozwala na krojenie. To zachowanie jest bardzo ważne w przypadku dużych lub twardych próbek

Nachylenie noża to kąt między powierzchnią noża a próbką. Aby uzyskać optymalny wynik, kąt ten musi być odpowiednio dobrany. Optymalny kąt zależy od geometrii noża, prędkości cięcia i wielu innych parametrów. Jeśli kąt jest ustawiony na zero, cięcie nożem może często stać się nieregularne i należy zastosować nowe położenie noża, aby to wygładzić.

Jeśli kąt jest zbyt duży, próbka może się zgnieść, a nóż może powodować okresowe zmiany grubości cięcia. Dalsze zwiększanie kąta do zbyt dużego może spowodować uszkodzenie samego ostrza noża.

Zobacz też

• Histologia
• Mikroskop

Linki zewnętrzne

• „Mikrotomia” . Encyclopædia Britannica (wyd. 11). 1911.