Szybka równoległa proteoliza
Szybka proteoliza równoległa ( FASTpp ) to metoda określania termostabilności białek poprzez pomiar, która frakcja białka jest odporna na szybkie trawienie proteolityczne .
Historia i tło
Proteoliza jest szeroko stosowana w biochemii i biologii komórki do badania struktury białek . W „ograniczonej proteolizie trypsyny” małe ilości proteazy trawią zarówno sfałdowane , jak i niezłożone białka, ale w znacznie różnych szybkościach: białka niestrukturalne są cięte szybciej, podczas gdy białka strukturalne są cięte z mniejszą szybkością (czasami o rzędy wielkości). Ostatnio zaproponowano kilka innych testów stabilności białek opartych na proteolizie, wykorzystujących inne proteazy o wysokiej specyficzności do rozszczepiania niesfałdowanych białek. Obejmują one proteolizę pulsacyjną, skaningową kalorymetrię proteolityczną i FASTpp.
Jak to działa
FASTpp mierzy ilość białka, które jest odporne na trawienie w różnych warunkach. W tym celu stosuje się termostabilną proteazę, która rozszczepia specyficznie odsłonięte hydrofobowe . Test FASTpp łączy termiczne rozwijanie, specyficzność termostabilnej proteazy dla niesfałdowanej frakcji z siłą rozdzielania SDS-PAGE . Dzięki tej kombinacji FASTpp może wykrywać zmiany we frakcji złożonej w szerokim zakresie warunków fizykochemicznych, w tym temperatury do 85°C, pH 6-9, obecność lub brak całego proteomu . Zastosowania sięgają od biotechnologii po badanie mutacji punktowych i testy wiązania ligandów .
Aplikacje
FASTpp został użyty do sondowania:
- Wpływ lizatu na stabilność białek
- Stabilność termiczna proteomu
- Połączone składanie i wiązanie
- Wpływ liganda na fałdowanie frakcji i stabilność
- Wpływ mutacji na fałdowanie frakcji i stabilność (np. mutacja punktowa / mutacje zmiany sensu )
- Stabilność kinetyczna białek
Technologia
Po pierwsze, lizat komórkowy jest generowany przez ubijanie szklanych kulek, homogenizację ciśnieniową lub chemiczne lub fizyczne metody lizy, które nie powodują denaturacji białek będących przedmiotem zainteresowania. (Opcjonalnie dla analizy ukierunkowanej) białko będące przedmiotem zainteresowania jest oczyszczane z tego lizatu metodami powinowactwa opartymi na wewnętrznie nieuporządkowanych znacznikach lub innych odpowiednich strategiach oczyszczania, często obejmujących kilka ortogonalnych etapów chromatograficznych.
Ten (całkowity lub oczyszczony) roztwór białka jest dzielony na porcje do kilku probówek paska PCR. Wszystkie porcje są eksponowane równolegle w termocyklerze PCR z gradientem termicznym na różne maksymalne temperatury w obecności termostabilnej proteazy termolizyny (patrz rysunek). Zautomatyzowaną kontrolę temperatury uzyskuje się w termocyklerze gradientowym (powszechnie używanym do reakcji PCR ). Produkty reakcji można rozdzielić metodą SDS-PAGE lub western blot . Proteaza termolizyna może być całkowicie inaktywowana przez EDTA . Ta cecha termolizyny sprawia, że FASTpp jest kompatybilny z późniejszym trawieniem trypsyną , np. do spektrometrii mas .