Test śladu DNazy

Ślad DNazy I białka wiążącego się ze znakowanym radioaktywnie fragmentem DNA. Ścieżki „GA” i „TC” to ścieżki chemicznego sekwencjonowania Maxama-Gilberta, patrz Sekwencjonowanie DNA . Ścieżka oznaczona jako „kontrola” służy do celów kontroli jakości i zawiera fragment DNA, ale nie traktowany DNazą I.

Test śladu DNazy to technika śledzenia DNA z biologii molekularnej / biochemii , która wykrywa interakcję DNA - białko , wykorzystując fakt, że białko związane z DNA często chroni ten DNA przed rozszczepieniem enzymatycznym. Umożliwia to zlokalizowanie miejsca wiązania białka na określonej cząsteczce DNA. Metoda wykorzystuje enzym, dezoksyrybonukleazę (w skrócie DNazę), do cięcia radioaktywnie znakowanego na końcach DNA, a następnie elektroforezę żelową w celu wykrycia powstałego wzoru rozszczepienia.

Na przykład interesujący fragment DNA można zamplifikować PCR przy użyciu startera znakowanego ^32P 5', w wyniku czego powstaje wiele cząsteczek DNA ze znacznikiem radioaktywnym na jednym końcu jednej nici każdej cząsteczki dwuniciowej. Rozszczepienie przez DNazę spowoduje powstanie fragmentów. Fragmenty, które są mniejsze w stosunku do ^32P , pojawią się dalej na żelu niż dłuższe fragmenty. Żel jest następnie używany do naświetlenia specjalnego filmu fotograficznego.

Wzór cięcia DNA pod nieobecność białka wiążącego DNA, typowo określanego jako wolny DNA, porównuje się ze wzorem cięcia DNA w obecności białka wiążącego DNA. Jeśli białko wiąże DNA, miejsce wiązania jest chronione przed rozszczepieniem enzymatycznym. Ta ochrona spowoduje wyraźny obszar na żelu, który jest określany jako „odcisk stopy”.

Zmieniając stężenie białka wiążącego DNA, powinowactwo wiązania białka można oszacować zgodnie z minimalnym stężeniem białka, przy którym obserwuje się ślad.

Technika ta została opracowana przez Davida Galasa i Alberta Schmitza w Genewie w 1977 roku

Zobacz też

• Ślad DNA
• DNaza I
• Test odcisku palca