Test hemaglutynacji
Test hemaglutynacji lub test hemaglutynacji ( HA ) i test hamowania hemaglutynacji ( HI lub HAI ) zostały opracowane w latach 1941–42 przez amerykańskiego wirusologa George'a Hirsta jako metody ilościowego określania względnego stężenia wirusów , bakterii lub przeciwciał.
HA i HI stosują proces hemaglutynacji , w którym receptory kwasu sialowego na powierzchni krwinek czerwonych (RBC) wiążą się z glikoproteiną hemaglutyniny znajdującą się na powierzchni wirusa grypy (i kilka innych wirusów) i tworzą sieć lub strukturę sieciową połączonych ze sobą czerwonych krwinek i cząstek wirusa. Zlepiona siatka utrzymuje erytrocyty w zawieszonej dystrybucji, zwykle postrzeganej jako rozproszony czerwonawy roztwór. Tworzenie sieci zależy od stężenia wirusa i erytrocytów, a gdy względne stężenie wirusa jest zbyt niskie, erytrocyty nie są ograniczane przez siatkę i osadzają się na dnie studzienki. Hemaglutynację obserwuje się w obecności gronkowców, wibratorów i innych gatunków bakterii, podobnie jak mechanizm wykorzystywany przez wirusy do powodowania aglutynacji erytrocytów. RBC stosowane w testach HA i HI pochodzą zazwyczaj od kur, indyków, koni, świnek morskich lub ludzi, w zależności od selektywności docelowego wirusa lub bakterii i związanych z nimi receptorów powierzchniowych na RBC.
Procedura
Ogólna procedura dla HA jest następująca: seryjne rozcieńczenia wirusa przygotowuje się w poprzek rzędów w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania w kształcie litery U lub V o dnie. Najbardziej stężona próbka w pierwszej studzience jest często rozcieńczana do 1/5x próbki wyjściowej, a kolejne studzienki są zazwyczaj dwukrotnymi rozcieńczeniami (1/10, 1/20, 1/40 itd.). Ostatnia studzienka służy jako kontrola negatywna bez wirusa. Każdy rząd płytki ma typowo inny wirus i ten sam wzór rozcieńczeń. Po seryjnych rozcieńczeniach do każdego dołka dodaje się wystandaryzowane stężenie krwinek czerwonych i delikatnie miesza. Płytkę inkubuje się przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po okresie inkubacji test można analizować w celu rozróżnienia studzienek z aglutynacją i bez aglutynacji. Obrazy w rzędzie będą zazwyczaj przechodzić od aglutynowanych dołków o wysokim stężeniu wirusa i rozproszonym czerwonawym wyglądzie do serii dołków o niskim stężeniu wirusa zawierających ciemnoczerwony osad lub guzik w środku dołka. Studzienki o niskim stężeniu wydają się prawie identyczne jak studzienki kontroli negatywnej bez wirusa. Pojawienie się guzika występuje, ponieważ krwinki czerwone nie są utrzymywane w aglutynowanej strukturze sieciowej i osadzają się w najniższym punkcie studzienki o dnie U lub V. Przejście od dołków z aglutynacją do dołków bez aglutynacji zachodzi wyraźnie, w obrębie 1 do 2 dołków.
Względne stężenie lub miano próbki wirusa opiera się na dołku z ostatnią aglutynacją, bezpośrednio przed zaobserwowaniem osadu. W stosunku do początkowego stężenia wyjściowego wirusa, stężenie wirusa w tej studzience będzie stanowić pewne rozcieńczenie wyjściowego, na przykład 1/40-krotne. Wartość miana tej próbki jest odwrotnością rozcieńczenia, tj. 40. W niektórych przypadkach wirus jest początkowo tak rozcieńczony, że nigdy nie obserwuje się zlepionych studzienek. W takim przypadku miano tych próbek jest zwykle przypisywane jako 5, co wskazuje na najwyższe możliwe stężenie, ale dokładność tej wartości jest wyraźnie niska. Alternatywnie, jeśli względne stężenie wirusa jest bardzo wysokie, a dołki nigdy nie przybierają wyglądu guzika. Wartość miana jest wtedy zwykle przypisywana jako najwyższe rozcieńczenie, takie jak 5120.
HI jest blisko spokrewniony z testem HA, ale obejmuje przeciwciała przeciwwirusowe jako „inhibitory” zakłócające interakcję wirus-RBC. Celem jest scharakteryzowanie stężenia przeciwciał w surowicy odpornościowej lub innych próbkach zawierających przeciwciała. Test HI jest generalnie wykonywany przez utworzenie serii rozcieńczeń surowicy odpornościowej w rzędach 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Każdy rząd byłby zwykle inną próbką. Do każdej studzienki dodaje się standaryzowaną ilość wirusa lub bakterii i mieszaninę pozostawia do inkubacji w temperaturze pokojowej na 30 minut. Ostatnia studzienka w każdym rzędzie byłaby kontrolą negatywną bez dodanego wirusa. Podczas inkubacji przeciwciała wiążą się z cząstkami wirusa, a jeśli stężenie i powinowactwo wiązania przeciwciał są wystarczająco wysokie, cząsteczki wirusa są skutecznie blokowane przed powodowaniem hemaglutynacji. Następnie do każdej studzienki dodaje się standaryzowaną ilość erytrocytów i pozostawia do inkubacji w temperaturze pokojowej na dodatkowe 30 minut. Otrzymane obrazy płytek HI zwykle przechodzą od nieaglutynowanych studzienek „guzikowych” z wysokim stężeniem przeciwciał do aglutynowanych, czerwonych studzienek rozproszonych z niskim stężeniem przeciwciał. Wartość miana HI jest odwrotnością ostatniego rozcieńczenia surowicy, które całkowicie zahamowało hemaglutynację.
Powyższe opisy procesów HA i HI są uogólnione, a konkretne szczegóły mogą się różnić w zależności od operatora i laboratorium. Na przykład opisano seryjne rozcieńczenia w rzędach, ale niektóre laboratoria stosują alternatywną orientację i zamiast tego wykonują rozcieńczenia w dół kolumn. Podobnie rozcieńczenie początkowe, współczynnik rozcieńczenia seryjnego, czasy inkubacji i wybór płytki z dnem w kształcie litery U lub V mogą zależeć od konkretnego laboratorium.
Zalety
HA i HI mają tę zaletę, że testy są proste, wykorzystują stosunkowo niedrogie i dostępne instrumenty i materiały oraz dostarczają wyniki w ciągu kilku godzin. Testy są również dobrze ugruntowane w wielu laboratoriach na całym świecie, co pozwala na pewną miarę wiarygodności, porównania i standaryzacji.
Ograniczenia
Optymalne i wiarygodne wyniki wymagają kontrolowania kilku zmiennych, takich jak czas inkubacji, stężenie krwinek czerwonych i rodzaj krwinek czerwonych. Niespecyficzne czynniki w próbce mogą prowadzić do interferencji i nieprawidłowych wartości miana. Na przykład cząsteczki w próbce inne niż przeciwciała specyficzne dla wirusa mogą hamować aglutynację między wirusem a krwinkami czerwonymi, jak również potencjalnie blokować wiązanie się przeciwciała z wirusem. Enzymy niszczące receptory (RDE) są powszechnie stosowane do obróbki próbek przed analizą, aby zapobiec niespecyficznemu hamowaniu. Analiza wyników HA lub HI zależy od wykwalifikowanej osoby, która odczyta tabliczkę i określi wartości miana. Ręczna metoda interpretacji wprowadza więcej możliwości rozbieżności w teście, ponieważ wyniki mogą być subiektywne, a porozumienie między czytelnikami jest niespójne. Ponadto nie ma cyfrowego zapisu oznaczeń na płytce ani miana, więc wstępna interpretacja jest żmudna i często wykonywana w powtórzeniach. Zakres potencjalnych zmiennych i różnice między ekspertami w czytaniu mogą utrudniać porównywanie wyników międzylaboratoryjnych.
Zobacz też
| składniki |  |
|
|---|---|---|
| Cykl życiowy wirusa | ||
| Genetyka | ||
| Przez gospodarza | ||
| Inny | ||
