Test immunologiczny światłowodu przestrzennego
 Prototypowa wersja testu immunologicznego światłowodu przestrzennego
| |
| Akronim | SOFIA |
|---|---|
| Używa | Medycyna, bezpieczeństwo żywności, przemysł, weterynaria |
| Godne uwagi eksperymenty | Wykrywanie prionów w moczu i krwi nosicieli przedklinicznych |
| Wynalazca | Narodowe Laboratorium Los Alamos i SUNY |
| Model | Prototyp |
Test immunologiczny światłowodu przestrzennego ( SOFIA ) to ultraczuła platforma do diagnostyki in vitro obejmująca zespół światłowodu przestrzennego , który wychwytuje emisje fluorescencji z całej próbki. Charakterystycznymi cechami tej technologii są niezwykle wysoka granica wykrywalności , czułość i zakres dynamiki . Czułość SOFIA jest mierzona na attogramu ( 10-18 g), co czyni go około miliard razy bardziej czułym niż konwencjonalne techniki diagnostyczne. W oparciu o rozszerzony zakres dynamiczny, SOFIA jest w stanie rozróżnić poziomy analitu w próbce ponad 10 rzędów wielkości , ułatwiając dokładne miareczkowanie . [ potrzebne źródło ]
Jako platforma diagnostyczna SOFIA ma szeroki zakres zastosowań. Kilka badań wykazało już bezprecedensową zdolność SOFIA do wykrywania naturalnie występujących prionów we krwi i moczu nosicieli chorób. Oczekuje się, że doprowadzi to do powstania pierwszego wiarygodnego testu przesiewowego przedśmiertnego na obecność vCJD , BSE , trzęsawki owiec , CWD i innych pasażowalnych encefalopatii gąbczastych . Biorąc pod uwagę wyjątkową czułość tej technologii, przewiduje się dodatkowe unikalne zastosowania, w tym in vitro testy na inne choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona .
SOFIA została opracowana w wyniku wspólnego projektu badawczego pomiędzy Los Alamos National Laboratory i State University of New York i była wspierana przez National Prion Research Program Departamentu Obrony .
Tło
Konwencjonalna metoda przeprowadzania fluorescencji indukowanej laserem, jak również innych typów pomiarów spektroskopowych , takich jak spektroskopia w podczerwieni , ultrafiolecie widzialnym , fosforescencja itp., polega na użyciu małego przezroczystego naczynia laboratoryjnego, kuwety , do przechowywania próbki być analizowane. [ potrzebne źródło ]
Aby wykonać pomiar, kuwetę napełnia się badaną cieczą, a następnie oświetla laserem skupionym przez jedną z powierzchni kuwety. Soczewkę umieszcza się w jednej linii z jedną z powierzchni kuwety umieszczoną pod kątem 90° od okienka wejściowego w celu zbierania indukowanego laserem światła fluorescencyjnego. Tylko niewielka część kuwety jest faktycznie oświetlana przez laser i wytwarza wykrywalną emisję spektroskopową. Sygnał wyjściowy jest znacznie zmniejszony, ponieważ soczewka odbiera tylko około 10% emisji spektroskopowej ze względu na kąt bryłowy. Ta technika jest używana od co najmniej 75 lat; jeszcze przed pojawieniem się lasera, kiedy do wzbudzania fluorescencji używano konwencjonalnych źródeł światła.
SOFIA rozwiązuje problem niskiej wydajności zbierania, ponieważ zbiera prawie całe światło fluorescencyjne wytwarzane z analizowanej próbki, zwiększając ilość sygnału fluorescencyjnego o około 10 razy w stosunku do konwencjonalnej aparatury.
Zalety technologiczne
SOFIA jest aparatem i metodą udoskonalonej geometrii optycznej w celu usprawnienia spektroskopowej detekcji analitów w próbce. Wynalazek już zademonstrował swoją funkcjonalność potwierdzającą słuszność koncepcji jako urządzenie i sposób ultraczułej detekcji prionów i innych analitów niskiego poziomu. SOFIA łączy swoistość charakterystyczną dla przeciwciał monoklonalnych do wychwytywania antygenu z czułością technologii detekcji optycznej surround. Aby wykrywać bardzo niskie poziomy sygnału, jako detektor systemu używana jest dioda fotowoltaiczna o niskim poziomie szumów. SOFIA wykorzystuje laser do oświetlania rurki mikrokapilarnej zawierającej próbkę. Następnie światło pobrane z próbki jest kierowane do przenoszenia optyki ze światłowodów. Następnie światło jest filtrowane optycznie w celu wykrycia, co jest wykonywane jako pomiar prądu wzmocniony przed szumem przez cyfrowe przetwarzanie sygnału ze wzmocnieniem. Wyniki wyświetlane są na komputerze i oprogramowaniu do akwizycji danych. [ potrzebne źródło ]
Zalety takiej matrycy detekcji są liczne. Przede wszystkim pozwala na optymalne zbadanie bardzo małych próbek o niskim stężeniu przy użyciu techniki fluorescencji indukowanej laserem. Ten światłowodowy system detekcji można dostosować do istniejących krótkoimpulsowych sprzętu wykrywającego, który został pierwotnie opracowany do sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek DNA. Geometria nadaje się również do zastosowania w schematach wykrywania pojedynczych cząsteczek za pomocą lasera krótkoimpulsowego. Wieloportowa geometria układu pozwala na wydajne elektroniczne przetwarzanie sygnałów z każdego ramienia urządzenia. Wreszcie, i być może najważniejsze, kable światłowodowe są zasadniczo w 100% wydajne w transmisji optycznej, mając tłumienie mniejsze niż 10 dB /km Tak więc, po wdrożeniu do użytku w obiekcie, informacje o fluorescencji mogą być przesyłane światłowodami do odległej lokalizacji, gdzie można przeprowadzać przetwarzanie i analizę danych.
Komponenty SOFIA
SOFIA obejmuje pojemnik na próbki płytki wielodołkowej, zautomatyzowany środek do sukcesywnego transportu próbek z pojemnika na próbkę płytki wielodołkowej do przezroczystej kapilary znajdującej się w uchwycie próbki, źródło wzbudzenia połączone optycznie z próbką, w którym promieniowanie ze źródła wzbudzenia jest kierowane wzdłuż długości kapilary, w którym promieniowanie indukuje sygnał, który jest emitowany z próbki, oraz co najmniej jeden układ liniowy. [ potrzebne źródło ]
Kroki w SOFII
Przygotowanie testu
Po amplifikacji, a następnie zatężeniu docelowego analitu, próbki są znakowane barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu przeciwciała w celu uzyskania specyficzności, a następnie ostatecznie umieszczane w probówce mikrokapilarnej. Ta rura jest umieszczona w specjalnie skonstruowanym aparacie, więc jest całkowicie otoczona włóknami optycznymi, które wychwytują całe światło emitowane po wzbudzeniu barwnika za pomocą lasera.
Przetwarzanie oprzyrządowania
Sprzęt ten jest aparatem spektroskopowym (zbierającym światło) i odpowiadającą mu metodą szybkiego wykrywania i analizowania analitów w próbce. Próbka jest napromieniowywana przez źródło wzbudzenia w komunikacji optycznej z próbką. Źródło wzbudzenia może obejmować między innymi laser, lampę błyskową, lampę łukową, diodę elektroluminescencyjną lub tym podobne.
Rysunek 1 przedstawia aktualną wersję systemu SOFIA. Cztery liniowe układy (101) rozciągają się od uchwytu próbki (102), w którym mieści się wydłużony, przezroczysty pojemnik próbki, który jest otwarty na obu końcach, do otworu końcowego (103). Dalszy koniec portu końcowego (104) jest wkładany do zespołu (200) portu końcowego. Liniowe układy (101) zawierają wiele włókien optycznych mających pierwszy koniec i drugi koniec, przy czym wiele włókien optycznych jest opcjonalnie otoczonych osłoną ochronną i/lub izolującą. Włókna światłowodowe są ułożone liniowo, co oznacza, że są one zasadniczo współpłaszczyznowe względem siebie tak, że tworzą wydłużony rząd włókien.
Aplikacje
Analit będący przedmiotem zainteresowania może mieć charakter biologiczny lub chemiczny i tylko przykładowo może obejmować ugrupowania chemiczne (toksyny, metabolity, leki i pozostałości leków), peptydy , białka, składniki komórkowe, wirusy i ich kombinacje. Interesujący analit może znajdować się w płynie lub w ośrodku podtrzymującym, takim jak żel.
SOFIA pokazała swój potencjał jako urządzenie o szerokim spektrum zastosowań. Należą do nich zastosowania kliniczne, takie jak wykrywanie chorób, wykrywanie predyspozycji do patologii, stawianie diagnozy i śledzenie skuteczności przepisanych terapii oraz zastosowania niekliniczne, takie jak zapobieganie przedostawaniu się toksyn i innych czynników chorobotwórczych do produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi:
- Zastosowania kliniczne – SOFIA może być wykorzystywana zarówno do przeprowadzania testów jakościowych (wyniki pozytywne lub negatywne) w celu wykrycia lub identyfikacji bakterii lub wirusów, jak i testów ilościowych (pomiar substancji) do wykrywania lub oznaczania ilościowego stałych biologicznych lub markerów, czyli substancji wytwarzanych przez organizm w obecności np. choroby zakaźnej (aby umożliwić określenie miana wirusa np. w terapii AIDS, czy poziomu toksyczności w wykrywaniu nadużywania leków).
- Zastosowania niekliniczne - Jako test immunologiczny SOFIA może być potencjalnie wykorzystywana na szerszą skalę do monitorowania jakości żywności, farmaceutyków, kosmetyków czy wody, a także ogólnych parametrów środowiskowych i produktów rolnych. Zdolność do wykrywania i badania przesiewowego bakterii i toksyn w szerokiej gamie produktów jest rosnącym i coraz bardziej złożonym wymogiem, o czym może świadczyć wzrost zachorowań na choroby przenoszone przez żywność i choroby przenoszone przez zwierzęta, takie jak E. coli, Salmonella, BSE , ptasia grypa itp.
przedśmiertny na choroby prionowe
SOFIA została wykorzystana do szybkiego wykrywania nieprawidłowej postaci białka prionowego ( PrP Sc ) w próbkach płynów ustrojowych, takich jak krew lub mocz. PrP Sc jest białkiem markerowym stosowanym w diagnostyce pasażowalnych encefalopatii gąbczastych ( TSE ), których przykładami są gąbczasta encefalopatia bydła ( tzw . Obecnie nie ma szybkich sposobów wykrywania przedubojowego PrP Sc w rozcieńczonych ilościach, w jakich zwykle występuje w płynach ustrojowych. SOFIA ma tę zaletę, że wymaga niewielkiego przygotowania próbki i umożliwia umieszczenie elektronicznego sprzętu diagnostycznego poza obszarem przechowawczym.
Tło
TSE lub choroby prionowe to zakaźne choroby neurodegeneracyjne ssaków, które obejmują gąbczastą encefalopatię bydła, przewlekłą wyniszczającą chorobę jeleni i łosi, trzęsawkę u owiec oraz chorobę Creutzfeldta-Jakoba (CJD) u ludzi. TSE mogą być przenoszone z gospodarza na gospodarza poprzez spożycie zakażonych tkanek lub transfuzję krwi. Objawy kliniczne TSE obejmują utratę ruchu i koordynacji oraz demencję u ludzi. Ich okresy inkubacji trwają od miesięcy do lat, ale po pojawieniu się objawów klinicznych szybko postępują, są nieuleczalne i niezmiennie śmiertelne. Próby ograniczenia ryzyka TSE doprowadziły do znaczących zmian w produkcji i handlu artykułami rolnymi, lekami, kosmetykami, krwiodawstwem i tkankami oraz produktami biotechnologicznymi. Neuropatologiczne badanie pośmiertne tkanki mózgowej zwierzęcia lub człowieka pozostaje „złotym standardem” w diagnostyce TSE i jest bardzo specyficzne, ale nie tak czułe jak inne techniki.
Aby poprawić bezpieczeństwo żywności, korzystne byłoby przebadanie wszystkich zwierząt pod kątem chorób prionowych przy użyciu badań przedśmiertnych , tj. testów przed wystąpieniem objawów. Jednak poziomy PrP Sc są bardzo niskie u gospodarzy przed objawami. Ponadto, PrP Sc są na ogół nierównomiernie rozmieszczone w tkankach ciała, przy czym najwyższe stężenie konsekwentnie stwierdza się w tkankach układu nerwowego, a bardzo niskie stężenia w łatwo dostępnych płynach ustrojowych, takich jak krew lub mocz. Dlatego każdy taki test byłby wymagany do wykrycia bardzo małych ilości PrP i musiałby różnicować PrP C i PrP Sc .
Obecne metody wykrywania PrP Sc są czasochłonne i wykorzystują analizę post mortem po tym, jak podejrzane zwierzęta wykazują jeden lub więcej objawów choroby. Obecne metody diagnostyczne opierają się głównie na wykrywaniu różnic fizykochemicznych pomiędzy PrP C i PrP Sc , które jak dotąd są jedynymi wiarygodnymi markerami TSE. Na przykład najczęściej stosowane testy diagnostyczne wykorzystują względną oporność PrP Sc na proteazy w próbkach mózgu do rozróżnienia między PrP C i PrP Sc w połączeniu z opartym na przeciwciałach wykrywaniem opornej na PK części PrPSc . Jak dotąd nie było możliwe wykrycie chorób prionowych przy użyciu konwencjonalnych metod, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy, serologia lub testy na hodowlach komórkowych. Kwas nukleinowy specyficzny dla czynnika nie został jeszcze zidentyfikowany, a zakażony gospodarz nie wywołuje odpowiedzi przeciwciał.
Konformacyjnie zmienioną formą PrP C jest PrP Sc . Niektóre grupy uważają, że PrP Sc jest czynnikiem zakaźnym (czynnikiem prionowym) w TSE, podczas gdy inne grupy nie. PrP Sc może być neuropatologicznym produktem procesu chorobowego, składnikiem czynnika zakaźnego, samym czynnikiem zakaźnym lub czymś zupełnie innym. Niezależnie od tego, jaka jest jego rzeczywista funkcja w stanie chorobowym, PrP Sc jest wyraźnie specyficznie związany z procesem chorobowym, a jego wykrycie wskazuje na zakażenie czynnikiem wywołującym choroby prionowe.
SOFIA jako test przedubojowy w kierunku chorób prionowych
SOFIA zapewnia między innymi metody diagnozowania chorób prionowych poprzez wykrywanie PrP Sc w próbkach biologicznych. Próbkami mogą być tkanki mózgowe, tkanki nerwowe, krew, mocz, płyn limfatyczny , płyn mózgowo-rdzeniowy lub ich kombinacja. Brak PrP Sc wskazuje na brak zakażenia czynnikiem zakaźnym do granic wykrywalności metod. Wykrycie obecności PrP Sc wskazuje na zakażenie czynnikiem zakaźnym związanym z chorobą prionową. Zakażenie czynnikiem prionowym można wykryć zarówno w przedobjawowych, jak i objawowych stadiach postępu choroby.
Te i inne ulepszenia zostały osiągnięte dzięki SOFIA. Czułość i specyficzność SOFIA eliminuje potrzebę trawienia PK w celu rozróżnienia normalnych i nieprawidłowych izoform PrP. Dalsze wykrywanie PrP Sc w osoczu krwi zostało rozwiązane przez ograniczoną cykliczną amplifikację nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA), a następnie SOFIA. Ze względu na czułość SOFIA cykle PMCA można zmniejszyć, zmniejszając w ten sposób szanse na samoistne PrP Sc tworzenie i wykrywanie próbek fałszywie dodatnich. SOFIA wychodzi naprzeciw potrzebom zwiększonej czułości w wykrywaniu chorób prionowych zarówno u zwierząt zakażonych TSE z objawami przedobjawowymi, jak i objawowymi, w tym ludzi, dostarczając metody analizy z wykorzystaniem bardzo czułej aparatury, która wymaga mniejszego przygotowania próbki niż wcześniej opisane metody, w połączeniu z niedawno opracowanymi Mab przeciwko PrP. Sposób obecnej wersji SOFIA zapewnia poziomy czułości wystarczające do wykrycia PrP Sc w tkance mózgowej. W połączeniu z ograniczonym sPMCA, sposoby według niniejszego wynalazku zapewniają poziomy czułości wystarczające do wykrycia PrP Sc w osoczu krwi, tkankach i innych płynach pobranych przedśmiertnie [ potrzebne źródło ] .
Metody łączą specyficzność Mab do wychwytywania i zatężania antygenu z czułością technologii wykrywania otaczającego światłowodu. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod wykrywania PrP Sc w homogenatach mózgowych, te techniki stosowane do badania homogenatów mózgowych nie wykorzystują polimeryzacji zaszczepionej, amplifikacji ani trawienia enzymatycznego (na przykład proteinazą K lub „PK”). Jest to ważne, ponieważ poprzednie raporty wskazywały na istnienie izoform PrP Sc ze zróżnicowaną czułością PK, co obniża wiarygodność testu. Czułość tego testu sprawia, że nadaje się on jako platforma do szybkiego testu wykrywania prionów w płynach biologicznych. Oprócz chorób prionowych, metoda może zapewnić środki do szybkiego, wysokowydajnego testowania szerokiego spektrum infekcji i zaburzeń.
Chociaż stwierdzono, że około 40 cykli sPMCA w połączeniu z immunoprecypitacją było niewystarczających do wykrywania PrP Sc w osoczu metodą ELISA lub western blotting, stwierdzono również, że PrP Sc można łatwo zmierzyć metodami SOFIA. Ograniczona liczba cykli niezbędnych dla obecnej platformy testowej praktycznie eliminuje możliwość uzyskania fałszywie dodatnich wyników związanych z PMCA, takich jak wcześniej zgłaszane (Thorne i Terry, 2008).
Inne zastosowania kliniczne
Wraz z szybkim rozwojem w dziedzinie badań nad biomarkerami, wiele infekcji i zaburzeń, których nie można było zdiagnozować za pomocą testów in vitro , staje się coraz bardziej możliwych. Przewiduje się, że projekt SOFIA będzie miał szersze zastosowanie w opracowywaniu testów diagnostycznych do wykrywania infekcji i zaburzeń wykraczających poza zakres chorób prionowych. Główne potencjalne zastosowanie dotyczy innych chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, w szczególności choroby Alzheimera.
Opublikowane badania
Badanie z 2011 roku wykazało wykrycie prionów w moczu owiec zakażonych w sposób naturalny i ustny klinicznym czynnikiem wywołującym trzęsawkę oraz zakażonych ustnie przedklinicznych i zakażonych jeleni bielików z kliniczną przewlekłą chorobą wyniszczającą (CWD). Jest to pierwsze doniesienie o wykrywaniu prionów PrP Sc w moczu naturalnie lub przedklinicznie chorych owiec lub jeleniowatych.
Badanie z 2010 roku wykazało, że umiarkowana ilość cyklicznej amplifikacji błędnego fałdowania białek (PMCA) w połączeniu z nowym schematem wykrywania SOFIA może być wykorzystana do wykrywania PrP Sc w osoczu nietraktowanym proteazą owiec trzęsawki przedklinicznej i klinicznej oraz jelenia bielika z przewlekłym wyniszczeniem choroby, po zakażeniu naturalnym i doświadczalnym. Związana z chorobą postać białka prionowego (PrP Sc ), wynikająca ze zmiany konformacyjnej normalnej (komórkowej) postaci białka prionowego (PrP C ), jest uważany za kluczowy dla neuropatogenezy i służy jako jedyny wiarygodny marker molekularny do diagnozy choroby prionowej. Podczas gdy najwyższe poziomy PrP Sc są obecne w OUN, opracowanie sensownego testu diagnostycznego wymaga użycia płynów ustrojowych, które charakterystycznie zawierają skrajnie niskie poziomy PrPSc . PrP Sc wykryto we krwi chorych zwierząt za pomocą technologii PMCA. Jednak powtarzane cykle przez kilka dni, które są konieczne w przypadku PMCA materiału krwi, powodują zmniejszenie swoistości (fałszywie dodatnie wyniki). Aby wygenerować test dla PrP Sc we krwi, która jest zarówno bardzo czuła, jak i specyficzna, naukowcy zastosowali ograniczone seryjne PMCA (sPMCA) z SOFIA. Nie znaleźli żadnego wzmocnienia sPMCA z dodatkiem kwasu poliadenylowego, ani nie było konieczne dopasowanie genotypów źródeł PrP C i PrP Sc dla wydajnej amplifikacji.
Badanie z 2009 roku wykazało, że SOFIA w swoim obecnym formacie jest w stanie wykryć mniej niż 10 attogramów (ag) rekombinowanego PrP chomika, owcy i jelenia. Około 10 μg PrP Sc z mózgów chomika zakażonego 263K można wykryć z podobnymi dolnymi granicami wykrywania PrP Sc z mózgów owiec i jeleni zakażonych trzęsawką owiec zakażonych przewlekłą chorobą wyniszczającą. Te granice wykrywalności pozwalają na rozcieńczenie materiału traktowanego i nietraktowanego proteazą poza punkt, w którym PrPC , niespecyficzne białka lub inny obcy materiał mogą zakłócać PrPSc wykrywanie i/lub specyficzność sygnału. To nie tylko eliminuje problem specyficzności wykrywania PrP Sc , ale także zwiększa czułość, ponieważ możliwość częściowej proteolizy PrP Sc nie jest już problemem. SOFIA prawdopodobnie doprowadzi do wczesnego przedśmiertnych pasażowalnych encefalopatii, a także nadaje się do stosowania z dodatkowymi protokołami amplifikacji docelowej. SOFIA stanowi czuły sposób wykrywania specyficznych białek zaangażowanych w patogenezę choroby i/lub diagnostykę, która wykracza poza zakres pasażowalnych encefalopatii gąbczastych.