Test ochrony przed nukleazami
Test ochrony przed nukleazą to technika laboratoryjna stosowana w biochemii i genetyce do identyfikacji poszczególnych cząsteczek RNA w heterogenicznej próbce RNA wyekstrahowanej z komórek . Technika ta może zidentyfikować jedną lub więcej cząsteczek RNA o znanej sekwencji nawet przy niskim stężeniu całkowitym . Wyekstrahowany RNA jest najpierw mieszany z antysensownymi sondami RNA lub DNA , które są komplementarne do sekwencji lub sekwencji będących przedmiotem zainteresowania, a komplementarne nici są hybrydyzowane tworząc dwuniciowy RNA (lub hybrydę DNA-RNA). Następnie mieszaninę poddaje się działaniu rybonukleaz , które specyficznie rozszczepiają tylko jednoniciowy RNA, ale nie wykazują aktywności wobec dwuniciowego RNA. Gdy reakcja przebiega do końca, wrażliwe regiony RNA ulegają degradacji do bardzo krótkich oligomerów lub pojedynczych nukleotydów ; fragmenty RNA, które przeżyły, to te, które były komplementarne do dodanej nici antysensownej iw ten sposób zawierały sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania.
Sonda
Sondy są przygotowywane przez klonowanie części genu będącego przedmiotem zainteresowania w wektorze pod kontrolą któregokolwiek z następujących promotorów, SP6, T7 lub T3. Promotory te są rozpoznawane przez zależne od DNA polimerazy RNA, pierwotnie scharakteryzowane z bakteriofagów. Wytworzone sondy są radioaktywne, ponieważ są przygotowywane w drodze transkrypcji in vitro przy użyciu radioaktywnych UTP. Niedopełniony DNA lub RNA jest odcinany przez nukleazy. Gdy sondą jest cząsteczka DNA, stosuje się nukleazę S1 ; gdy sondą jest RNA, można zastosować dowolną rybonukleazę specyficzną dla pojedynczej nici. Tak więc dopełniacz mRNA, który przeżył, jest po prostu wykrywany przez autoradiografię.
Używa
Testy ochrony przed nukleazami stosuje się do mapowania intronów oraz końców 5' i 3' transkrybowanych regionów genów . Można uzyskać wyniki ilościowe dotyczące ilości docelowego RNA obecnego w oryginalnym ekstrakcie komórkowym – jeśli celem jest matrycowy RNA , może to wskazywać na poziom transkrypcji genu w komórce.
Służą również do wykrywania obecności dwuniciowego RNA, którego obecność może oznaczać interferencję RNA.
Northern blotting to technika laboratoryjna, która daje podobne informacje. Jest wolniejszy i mniej ilościowy, ale dostarcza również dokładnych informacji o wielkości docelowego RNA. Produkty testu ochrony przed nukleazą są ograniczone do wielkości początkowych sond ze względu na zniszczenie niezhybrydyzowanego RNA podczas etapu trawienia nukleazą.