Wirusowe śledzenie neuronów

Neuron PC12 zakażony wirusem wścieklizny rzekomej PRV GS443 (oznaczony na zielono). Zielone kropki oddalające się od ciała komórki wskazują na transport wsteczny .

Wirusowe śledzenie neuronalne polega na wykorzystaniu wirusa do śledzenia ścieżek neuronowych , dostarczając samoreplikującego się znacznika . Wirusy mają przewagę w zakresie samoreplikacji nad znacznikami molekularnymi, ale mogą również rozprzestrzeniać się zbyt szybko i powodować degradację tkanki nerwowej. Wirusy, które mogą infekować układ nerwowy, zwane wirusami neurotropowymi , rozprzestrzeniają się poprzez przestrzennie bliskie skupiska neuronów poprzez synapsy , co pozwala na ich wykorzystanie do badania funkcjonalnie połączonych sieci neuronowych.

Wykorzystanie wirusów do oznaczania funkcjonalnie połączonych neuronów wywodzi się z prac i testów biologicznych opracowanych przez Alberta Sabina . Późniejsze badania pozwoliły na włączenie immunohistochemicznych do systematycznego znakowania połączeń neuronalnych. Do tej pory wirusy były wykorzystywane do badania wielu obwodów w układzie nerwowym.

Historia

Poszczególne połączenia neuronów od dawna wymykały się neuroanatomom . Metody śledzenia neuronów zapewniają bezprecedensowy wgląd w morfologię i łączność sieci neuronowych. W zależności od zastosowanego znacznika, może to być ograniczone do pojedynczego neuronu lub może przebiegać transsynoptycznie do sąsiednich neuronów. Po wystarczającym rozprzestrzenieniu się znacznika, zasięg można zmierzyć za pomocą fluorescencji (w przypadku barwników) lub immunohistochemii (w przypadku znaczników biologicznych). Ważną innowacją w tej dziedzinie jest zastosowanie wirusów neurotropowych jako znaczniki. Te nie tylko rozprzestrzeniają się w początkowym miejscu infekcji, ale mogą przeskakiwać przez synapsy .

Użycie wirusa zapewnia samoreplikujący się znacznik. Pozwala to na wyjaśnienie mikroukładów nerwowych w stopniu, który był wcześniej nieosiągalny. Ma to istotne implikacje dla świata rzeczywistego. Lepsze zrozumienie ścisłego połączenia między różnymi częściami mózgu prowadzi do lepszego przewidywania skutków miejscowego uszkodzenia mózgu. Na przykład, jeśli pacjent ma udar w ciele migdałowatym (głównie odpowiedzialnym za emocje ), pacjent może również mieć problemy z nauką wykonywania pewnych zadań, ponieważ ciało migdałowate jest silnie połączone z korą oczodołowo-czołową , który jest odpowiedzialny za uczenie się przez nagrodę .

Cykl życia wirusa

Cykl życiowy wirusów, takich jak te stosowane w śledzeniu neuronów, różni się od cyklu życiowego organizmów komórkowych . Wirusy są pasożytnicze i nie mogą rozmnażać się samodzielnie. Dlatego muszą zarazić inny organizm i skutecznie przejąć maszynerię komórkową, aby zakończyć swój cykl życiowy.

Pierwszy etap cyklu życiowego wirusa nazywa się wejściem wirusowym . Określa sposób, w jaki wirus infekuje nową komórkę gospodarza. W naturze wirusy neurotropowe są zwykle przenoszone przez ukąszenia lub zadrapania, jak w przypadku wirusa wścieklizny lub niektórych szczepów wirusów opryszczki . W badaniach śledzenia krok ten odbywa się sztucznie, zwykle za pomocą strzykawki. Następny etap cyklu życiowego wirusa nazywany jest replikacją wirusa . Na tym etapie wirus przejmuje maszynerię komórki gospodarza, powodując, że komórka wytwarza więcej białek wirusowych i gromadzi więcej wirusów.

Gdy komórka wytworzy wystarczającą liczbę wirusów, wirus wchodzi w fazę wydalania wirusa . Na tym etapie wirusy opuszczają pierwotną komórkę gospodarza w poszukiwaniu nowego gospodarza. W przypadku wirusów neurotropowych transmisja ta zwykle zachodzi w synapsie . Wirusy mogą przeskakiwać przez stosunkowo krótką przestrzeń z jednego neuronu do drugiego. Ta cecha sprawia, że ​​wirusy są tak przydatne w badaniach znaczników.

Kiedy wirus dostanie się do następnej komórki, cykl zaczyna się od nowa. Oryginalna komórka gospodarza zaczyna się rozkładać po etapie zrzucania. W badaniach znaczników jest to powód, dla którego czas musi być ściśle kontrolowany. Jeśli pozwoli się wirusowi rozprzestrzenić się zbyt daleko, pierwotny mikroukład będący przedmiotem zainteresowania ulegnie degradacji i nie będzie można odzyskać żadnych użytecznych informacji. Zazwyczaj wirusy mogą zainfekować tylko niewielką liczbę organizmów, a nawet wtedy tylko określony typ komórek w organizmie. Specyficzność konkretnego wirusa dla określonej tkanki jest znana jako jego tropizm . Wszystkie wirusy w badaniach znaczników są neurotropowe (zdolne do infekowania neuronów).

Metody

Infekcja

Wirusowy znacznik można wprowadzić do narządów obwodowych, takich jak mięsień lub gruczoł . Niektóre wirusy, takie jak wirus związany z adenowirusem , mogą zostać wstrzyknięte do krwioobiegu i mogą przekroczyć barierę krew-mózg , infekując mózg. Można go również wprowadzić do zwoju lub wstrzyknąć bezpośrednio do mózgu za pomocą urządzenia stereotaktycznego . Metody te oferują unikalny wgląd w to, w jaki sposób mózg i jego obwód są połączone.

Wirusy są wprowadzane do tkanki nerwowej na wiele różnych sposobów. Istnieją dwie główne metody wprowadzania znacznika do tkanek docelowych.

  1. Wtrysk ciśnieniowy wymaga wstrzyknięcia znacznika w postaci płynnej bezpośrednio do komórki. Jest to najczęstsza metoda.
  2. Jonoforeza polega na doprowadzeniu prądu do roztworu znacznika w elektrodzie. Cząsteczki znacznika pobierają ładunek i są wprowadzane do komórki za pośrednictwem pola elektrycznego. Jest to przydatna metoda, jeśli chcesz oznaczyć komórkę po wykonaniu patch clamp .

Po wprowadzeniu znacznika do komórki przejmują wspomniane wcześniej mechanizmy transportowe. Następnie wirus zaczyna infekować komórki w okolicy, gdy dostanie się do układu nerwowego. Wirusy działają poprzez włączanie własnego materiału genetycznego do genomu zainfekowanych komórek. Komórka gospodarza będzie następnie wytwarzać białka kodowane przez gen. Naukowcy są w stanie wprowadzić liczne geny do zainfekowanych neuronów, w tym fluorescencyjne wykorzystywane do wizualizacji. Dalsze postępy w śledzeniu neuronów umożliwiają ukierunkowaną ekspresję białek fluorescencyjnych do określonych typów komórek.

Histologia i obrazowanie

Gdy wirus rozprzestrzeni się do pożądanego stopnia, mózg jest krojony i umieszczany na szkiełkach. Następnie przeciwciała fluorescencyjne , które są albo specyficzne dla wirusa, albo fluorescencyjne komplementarne sondy DNA dla wirusowego DNA, są przemywane przez skrawki i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym .

Kierunek transmisji

Transmisja wirusa opiera się na mechanizmie transportu aksoplazmatycznego . Wewnątrz aksonu znajdują się długie, smukłe kompleksy białkowe zwane mikrotubulami . Działają jak cytoszkielet , pomagając komórce zachować swój kształt. Mogą one również działać jako autostrady w obrębie aksonu i ułatwiać transport wypełnionych neuroprzekaźnikami pęcherzyków i enzymów tam iz powrotem między ciałem komórki, czyli somą , a zakończeniem aksonu, czyli synapsą .

Wirusy mogą być transportowane w jednym z dwóch kierunków: w przód (od somy do synapsy) lub wstecznie (od synapsy do somy). Neurony w naturalny sposób transportują białka , neuroprzekaźniki i inne makrocząsteczki za pośrednictwem tych szlaków komórkowych. Wskaźniki neuronalne, w tym wirusy, wykorzystują te mechanizmy transportowe do dystrybucji znacznika w komórce. Naukowcy mogą to wykorzystać do badania obwodów synaptycznych.

Transport wsteczny

Śledzenie wsteczne to użycie znacznika, który przemieszcza się z somy do synapsy. Transport wsteczny wykorzystuje białko zwane kinezyną do przemieszczania wirusów wzdłuż aksonu w kierunku wstecznym.

Transport wsteczny

Śledzenie wsteczne to użycie znacznika, który przemieszcza się z synapsy do somy. Transport wsteczny wykorzystuje białko zwane dyneiną do przemieszczania wirusów wzdłuż aksonu w kierunku wstecznym. Należy zauważyć, że różne znaczniki wykazują charakterystyczne powinowactwo do dyneiny i kinezyny, a zatem będą się rozprzestrzeniać z różną szybkością.

Podwójny transport

Czasami pożądane jest śledzenie neuronów w górę iw dół, aby określić zarówno wejścia, jak i wyjścia obwodów neuronowych. Wykorzystuje to kombinację powyższych mechanizmów.

Korzyści i wady

Korzyści

Jedną z korzyści stosowania znaczników wirusowych jest zdolność wirusa do przeskakiwania przez synapsy. Pozwala to na śledzenie mikroukładów, a także badania projekcyjne. Niewiele znaczników molekularnych jest w stanie to zrobić, a te, które zwykle mają zmniejszony sygnał w neuronach wtórnych, co prowadzi do innej korzyści ze śledzenia wirusów - wirusy mogą się samoreplikować. Gdy tylko neuron wtórny zostanie zainfekowany, wirus zaczyna się namnażać i replikować. Nie ma utraty sygnału, gdy znacznik rozprzestrzenia się w mózgu.

Wady

Gdy wirusy rozprzestrzeniają się w układzie nerwowym, znaczniki wirusowe infekują neurony i ostatecznie je niszczą. W związku z tym czas badań znaczników musi być precyzyjny, aby umożliwić odpowiednią propagację, zanim nastąpi śmierć neuronów, powodująca szkody w organizmie na dużą skalę.

Trudno było znaleźć wirusy idealnie nadające się do tego zadania. Wirus używany do śledzenia powinien być średnio zakaźny, aby dawał dobre wyniki, ale nie zabójczy, aby zbyt szybko niszczył tkankę nerwową lub stwarzał niepotrzebne ryzyko dla osób narażonych.

Inną wadą jest to, że wirusowe śledzenie neuronów wymaga obecnie dodatkowego etapu przyłączania przeciwciał fluorescencyjnych do wirusów w celu wizualizacji ścieżki. W przeciwieństwie do tego, większość znaczników molekularnych ma jaskrawe kolory i można je oglądać gołym okiem, bez dodatkowych modyfikacji.

Bieżące zastosowania

Śledzenie wirusów służy przede wszystkim do śledzenia obwodów neuronalnych. Naukowcy wykorzystują jeden z wcześniej wspomnianych wirusów do bardzo szczegółowego badania, w jaki sposób neurony w mózgu są ze sobą połączone. Łączność w dużej mierze określa sposób funkcjonowania mózgu. Wirusy były używane między innymi do badania obwodów zwojowych siatkówki, obwodów korowych i obwodów rdzeniowych.

Wirusy w użyciu

Poniżej znajduje się lista wirusów obecnie używanych do śledzenia neuronów.

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Viral_neuronal_tracing&oldid=1125482734 ”