Zymografia
Zymografia jest techniką elektroforetyczną służącą do wykrywania enzymów hydrolitycznych , opartą na repertuarze substratów enzymu. Stosowane są trzy rodzaje zymografii; w zymografii żelowej, zymografii in situ i zymografii in vivo Na przykład żelatyna osadzona w żelu poliakryloamidowym będzie trawiona przez aktywne żelatynazy przepuszczane przez żel. Po barwieniu Coomassie , obszary degradacji są widoczne jako wyraźne pasy na ciemno poplamionym tle.
Współczesne użycie terminu zymografia zostało dostosowane do zdefiniowania badania i katalogowania produktów fermentowanych, takich jak piwo lub wino, często przez określonych piwowarów lub winiarzy lub w ramach określonej kategorii fermentacji, takiej jak określony szczep drożdży lub gatunek bakterii . Zymografia odnosi się również do zbioru powiązanych, sfermentowanych produktów, uważanych za zbiór prac. Na przykład wszystkie piwa produkowane przez dany browar można zbiorczo określić jako jego zymografię.
Zobacz także zymologię lub naukę stosowaną zymografii. Zymologia odnosi się do biochemicznych procesów fermentacji, zwłaszcza selekcji fermentujących drożdży i bakterii w piwowarstwie, produkcji wina i innych sfermentowanych produktach spożywczych. Na przykład warzenie piwa polega na zastosowaniu drożdży górnej (ale) lub dolnej fermentacji (lager) w celu wyprodukowania pożądanej odmiany piwa. Synteza drożdży może mieć wpływ na profil smakowy piwa, czyli diacetylu (smak lub aromat maślany, karmelowy).
Zymografia żelowa
Próbki przygotowuje się w standardowym, nieredukującym buforze ładującym do SDS-PAGE . Żaden środek redukujący ani gotowanie nie są konieczne, ponieważ przeszkadzałyby one w ponownym fałdowaniu enzymu. Odpowiedni substrat (np. żelatyna lub kazeina do wykrywania proteaz) jest osadzony w żelu rozdzielającym podczas przygotowywania żelu akryloamidowego . Po elektroforezie SDS usuwa się z żelu (lub zymogramu ) przez inkubację w niebuforowanym Tritonie X-100 , a następnie inkubować w odpowiednim buforze do trawienia przez zoptymalizowany czas w temperaturze 37 °C. Zymogram jest następnie barwiony (zwykle Amido Black lub Coomassie brylantowym błękitem ), a obszary trawienia pojawiają się jako wyraźne prążki na ciemno zabarwionym tle, gdzie substrat został zdegradowany przez enzym.
Wariacje standardowego protokołu
Standardowy protokół może wymagać modyfikacji w zależności od enzymu próbki; na przykład glikozydazy trawienne D. melanogaster generalnie przeżywają warunki redukujące (tj. obecność 2-merkaptoetanolu lub DTT ) i do pewnego stopnia ogrzewanie. Rzeczywiście, rozdziały po podgrzaniu do 50°C mają tendencję do wykazywania znacznego wzrostu rozdzielczości pasma, bez zauważalnej utraty aktywności.
Powszechnym protokołem stosowanym w przeszłości do zymografii aktywności α-amylazy był tzw. protokół filmu skrobiowego WW Doane'a. Tutaj uruchomiono natywny żel PAGE w celu rozdzielenia białek w homogenacie. Następnie cienki żel z rozpuszczoną w nim skrobią (a dokładniej zawieszoną) został nałożony na pewien czas na oryginalny żel. Skrobię następnie barwiono płynem Lugola.
Zymografia żelowa jest często stosowana do wykrywania i analizy enzymów wytwarzanych przez mikroorganizmy. Doprowadziło to do zmian w standardowym protokole, np. zymografii mieszanych substratów.
Odwrócona zymografia kopolimeryzuje zarówno substrat, jak i enzym z akryloamidem i jest przydatna do wykazania aktywności inhibitora enzymu . Po barwieniu obszary zahamowania są wizualizowane jako ciemne prążki na przezroczystym (lub lekko zabarwionym) tle.
W technice odcisku enzym jest rozdzielany za pomocą elektroforezy na żelu natywnym i żel jest nakładany na agarozę traktowaną substratem .
Zymografię można również zastosować do innych rodzajów enzymów, w tym ksylanaz , lipaz i chitynaz.