dideoksynukleotyd
Dideoksynukleotydy to wydłużające łańcuchy inhibitory polimerazy DNA , stosowane w metodzie Sangera do sekwencjonowania DNA . Są one również znane jako 2', 3', ponieważ obie pozycje 2' i 3' na rybozie nie mają grup hydroksylowych i są określane skrótem ddNTP (ddGTP, ddATP, ddTTP i ddCTP).
Rola w metodzie Sangera
Metoda Sangera służy do amplifikacji docelowego segmentu DNA, dzięki czemu można precyzyjnie określić sekwencję DNA. Włączenie ddNTP do zaworów reakcyjnych jest po prostu wykorzystywane do zakończenia syntezy rosnącej nici DNA, w wyniku czego powstają częściowo replikowane fragmenty DNA. Dzieje się tak, ponieważ polimeraza DNA wymaga grupy 3' OH rosnącego łańcucha i grupy fosforanowej 5' nadchodzącego dNTP, aby utworzyć wiązanie fosfodiestrowe . Czasami polimeraza DNA włączy ddNTP i brak grupy 3' OH przerwie reakcję kondensacji między 5' fosforanem (po rozszczepieniu pirofosforanu ) nadchodzącego nukleotydu z grupą hydroksylową 3' poprzedniego nukleotydu na rosnące pasmo. Ta reakcja kondensacji normalnie zachodziłaby przy włączeniu niezmodyfikowanego dNTP przez polimerazę DNA. Mówiąc najprościej, atak nukleofilowy grupy 3' OH prowadzi do dodania nukleotydu do rosnącego łańcucha. Brak grupy hydroksylowej 3' hamuje ten atak nukleofilowy, uniemożliwiając polimerazie DNA kontynuowanie swojej funkcji.
To odkrycie doprowadziło do jego właściwej nazwy „nukleotydy kończące łańcuch”. Dideoksyrybonukleotydy nie mają grupy hydroksylowej 3', stąd dalsze wydłużanie łańcucha nie może nastąpić, gdy ten dideoksynukleotyd znajdzie się na łańcuchu. Może to prowadzić do zakończenia sekwencji DNA. Zatem cząsteczki te stanowią podstawę sekwencjonowania DNA z terminacją łańcucha dideoksy , którą opisał Frederick Sanger i jego zespół w 1977 roku jako rozszerzenie wcześniejszych prac. Podejście Sangera zostało opisane w 2001 roku jako jedna z dwóch podstawowych metod sekwencjonowania fragmentów DNA (drugą jest metoda Maxama-Gilberta ), ale metoda Sangera jest zarówno „najczęściej stosowaną, jak i metodą stosowaną przez większość zautomatyzowanych sekwenatorów DNA”. Sanger zdobył swoją drugą Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1980 roku, dzieląc się nią z Walterem Gilbertem („za ich wkład w określanie sekwencji zasad w kwasach nukleinowych”) i Paulem Bergiem („za fundamentalne badania biochemii kwasów nukleinowych, z ze szczególnym uwzględnieniem rekombinowanego DNA ”) i omówił zastosowanie dideoksynukleotydów w swoim wykładzie noblowskim.
Sekwencjonowanie DNA
Dideoksynukleotydy są przydatne w sekwencjonowaniu DNA w połączeniu z elektroforezą . Próbka DNA poddana PCR ( reakcji łańcuchowej polimerazy ) w mieszaninie zawierającej wszystkie cztery deoksynukleotydy i jeden dideoksynukleotyd wytworzy nici o długości równej pozycji każdej zasady typu, który uzupełnia typ zawierający obecny dideoksynukleotyd. Polimeraza taq stosowana w PCR faworyzuje ddGNTP, co było wzorem obserwowanym w różnych badaniach. Oznacza to, że każda zasada nukleotydowa tego konkretnego typu ma prawdopodobieństwo wiązania się nie z deoksynukleotydem, ale raczej z dideoksynukleotydem, co kończy wydłużanie łańcucha. Dlatego też, jeśli próbka zostanie następnie poddana elektroforezie, będzie obecny prążek dla każdej długości, przy której dopełnienie dideoksynukleotydu. Obecnie powszechne jest stosowanie fluorescencyjnych dideoksynukleotydów, tak że każdy z czterech ma inną fluorescencję, którą można wykryć za pomocą sekwencera; zatem potrzebna jest tylko jedna reakcja.
Produkcja
W opatentowanej metodzie tetrahydrofuran stosowano w rozpuszczalniku zawierającym 50 g (0,205 mola) urydyny (lub przypuszczalnie dowolnego niezabezpieczonego nukleozydu ), 112 ml (1,03 mola) ortomrówczanu metylu i 10 g (52,6 mmola) kwasu paratoluenosulfonowego w temp . temperaturze pokojowej mieszając. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, mieszaninę reakcyjną wylano do wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, po czym ekstrahowano 5 razy chloroformem. Ekstrakt wysuszono nad siarczanem sodu i zatężono, w wyniku czego otrzymano 49,5 g (0,173 mola) 2',3'-o-metoksymetylideneurydyny (wydajność 84,5%). Po tej reakcji przykładowy produkt urydyny, 2',3'-o-metoksymetylideneurydynę, rozpuszcza się w temperaturze pokojowej, mieszając, w 50 ml bezwodnika octowego . Roztwór ogrzano do 140°C i utrzymywano w tej temperaturze przez 5 godzin pod chłodnicą zwrotną rozpuszczalnika. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej rozpuszczalnik usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem, dodano 50 ml wody i mieszaninę ekstrahowano 3 razy 100 ml chloroformu. Ekstrakt zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, 30% wodą amoniakalną, otrzymując 2',3'-dideoksy-2',3'-didehydrourydynę z wydajnością 82,3%. Ten przykładowy produkt jest następnie uwodniony w celu usunięcia wiązania podwójnego poprzez rozpuszczenie go w metanolu (10 ml) zawierającym katalizator (mokry 5% pallad na węglu) (400 mg) w atmosferze wodoru przez 1 godzinę, aby otrzymać otrzymany dideoksynukleozyd ( 2 w tym przypadku ,3'-dideoksyurydyna). Stosowany nukleotyd barwnika prawdopodobnie nastąpi w wyniku traktowania enzymem fosforylującym oraz biotynylacji i reakcji biotynylowanej substancji z barwnikiem. Możliwe, że może również wystąpić natychmiastowa reakcja z barwnikiem, ale uważa się, że wydłużenie ramienia zwiększa wydajność w przypadku użycia zmutowanej formy polimerazy DNA
Linki zewnętrzne
-
Media związane z dideoksynukleotydami w Wikimedia Commons
