plamka północno-zachodnia
Northwestern blot , znany również jako test północno-zachodni , jest hybrydową techniką analityczną Western blot i Northern blot , stosowaną w biologii molekularnej do wykrywania interakcji między RNA a białkami . Pokrewna technika, Western blot, jest stosowana do wykrywania białka będącego przedmiotem zainteresowania, które obejmuje przeniesienie białek rozdzielonych za pomocą elektroforezy żelowej na membranę nitrocelulozową. Kolorowy osad gromadzi się wzdłuż pasma na membranie zawierającej określone białko docelowe. Northern blot to podobna technika analityczna, która zamiast wykrywania białka będącego przedmiotem zainteresowania służy do badania ekspresji genów poprzez wykrywanie RNA (lub izolowanego mRNA) na podobnej błonie. Northwestern blot łączy te dwie techniki i w szczególności obejmuje identyfikację znakowanego RNA, które oddziałuje z białkami unieruchomionymi na podobnej membranie nitrocelulozowej.
Historia
Edwin Southern jako pierwszy stworzył Southern blot , technikę analityczną używaną do wykrywania DNA. Technika ta polega na zastosowaniu elektroforezy żelowej , ważnej metody analitycznej, która obejmuje użycie pola elektrycznego, a następnie migrację naładowanego DNA, RNA lub białek przez to pole elektryczne w oparciu o wielkość i ładunek. Za pomocą Southern Blot oddzielone fragmenty DNA są następnie przenoszone na filtr membranowy w celu wykrycia. Wykrywanie następuje, gdy prążki stają się widoczne na membranie i korelują z konkretną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Następnie stworzono inne podobne techniki blottingu z podobną nomenklaturą w celu wykrywania różnych cząsteczek lub interakcji między cząsteczkami. Techniki te obejmują m.in Western blot (wykrywanie białka), Northern blot (wykrywanie RNA), południowo-zachodni blot (wykrywanie interakcji DNA-białko), wschodni blot (wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych) i północno-zachodni blot (wykrywanie interakcji RNA-białko).
Specyfika techniki
Przeprowadzenie testu północno-zachodniego polega na rozdzieleniu białek wiążących RNA za pomocą elektroforezy żelowej , która oddzieli białka wiążące RNA na podstawie ich wielkości i ładunku. Pojedyncze próbki można umieścić w agarozowym lub poliakryloamidowym (zwykle SDS-PAGE) w celu jednoczesnej analizy wielu próbek. Po zakończeniu elektroforezy żelowej żel i związane z nim białka wiążące RNA przenosi się na nitrocelulozowy papier transferowy.
Nowo przeniesione bloty są następnie moczone w roztworze blokującym; odtłuszczonego mleka i albuminy surowicy bydlęcej są zwykłymi buforami blokującymi. Ten roztwór blokujący pomaga zapobiegać niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał pierwszorzędowych i/lub drugorzędowych z błoną nitrocelulozową. Gdy roztwór blokujący ma odpowiedni czas kontaktu z blotem, nakłada się RNA specyficznego konkurenta i pozostawia czas na inkubację w temperaturze pokojowej. W tym czasie RNA konkurenta wiąże się z białkami wiążącymi RNA w próbkach, które znajdują się na blocie. Czas inkubacji podczas tego procesu może się różnić w zależności od zastosowanego stężenia konkurencyjnego RNA; chociaż czas inkubacji wynosi zwykle jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji, blot jest zwykle płukany co najmniej 3 razy przez 5 minut za każdym razem, w celu rozcieńczenia RNA w roztworze. Typowe bufory do przemywania obejmują Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) lub 10% roztwór Tween 20 . Niewłaściwe lub nieodpowiednie mycie wpłynie na przejrzystość powstającej plamy. Po zakończeniu przemywania, blot jest następnie zwykle wywoływany za pomocą promieni rentgenowskich lub podobnych metod autoradiografii .
Aplikacje
Po wywołaniu blotu za pomocą promieni rentgenowskich lub autoradiografii, wyniki można analizować i interpretować w celu określenia przybliżonej wielkości i stężenia białka wiążącego RNA będącego przedmiotem zainteresowania w celu dalszego badania białka. Umiejscowienie i stężenie białka wiążącego RNA na błocie może wpływać na wyniki, a czasami po wywołaniu mogą pojawić się prążki. Te prążki mogą pomóc naukowcom określić rozmiar i stężenie białka wiążącego RNA będącego przedmiotem zainteresowania. Gdy znany jest przybliżony rozmiar białka, oryginalną próbkę można poddać chromatografii maszynę do rozdzielenia według rozmiaru. Ponadto, po wyizolowaniu białka, można je trawić trypsyną, a spektrometrię mas można wykorzystać do sekwencjonowania peptydów w celu określenia tożsamości konkretnego białka.
Zalety i wady
Zalety blottingu północno-zachodniego obejmują przyspieszone wykrywanie określonych białek wiążących RNA, a także ocenę przybliżonej masy cząsteczkowej tych białek. Northwestern blot pozwala na wykrywanie zidentyfikowanych białek w niedrogi sposób. Blot jest zazwyczaj pierwszym krokiem w badaniach, ponieważ pozwala na identyfikację przybliżonych mas cząsteczkowych, a gdy masa cząsteczkowa jest znana, umożliwia dalsze badania lub oczyszczanie innymi metodami, takimi jak chromatografia. Inną zaletą blotu północno-zachodniego jest to, że pomaga on w budowaniu bibliotek ekspresyjnych pokrewnych ligandów.
Zauważoną wadą jest to, że niektóre interakcje RNA-białko o słabych właściwościach wiązania RNA mogą nie być tak wykrywalne tą techniką. Również procedura blottingu może trwać od 3 do 5 godzin. Jeśli procedura nie zostanie przeprowadzona prawidłowo, może to spowodować znaczne tło, które może skutkować niejasnym plamem zidentyfikowanych białek. Ponadto białka muszą renaturować po rozdzieleniu i przeniesieniu na membranę nitrocelulozową. Ostatnią wadą jest to, że białka muszą składać się z pojedynczego polipeptydu lub dwóch podjednostek, które migrują w matrycy żelowej.
Zobacz też
- Southern blot
- Western blot
- Northern blot
- Plamka południowo-zachodnia
- plama wschodnia
- Elektroforeza żelowa
- STRONA SDS
- Chromatografia
Protokoły
Northwestern Blot interakcji białko-RNA z młodych wiech ryżowych
Izolacja RNA i analiza metodą Northern Blot