Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej
Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) lub elektroforeza przesunięcia ruchliwości , określana również jako test przesunięcia żelu , test przesunięcia ruchliwości żelu , test przesunięcia pasma lub test opóźnienia żelowania , jest powszechną techniką elektroforezy powinowactwa stosowaną do badania białka-DNA lub białka - Interakcje RNA . Ta procedura może określić, czy białko lub mieszanina białek jest zdolna do wiązania się z daną sekwencją DNA lub RNA, a czasami może wskazać, czy więcej niż jedna cząsteczka białka jest zaangażowana w kompleks wiążący. Testy przesunięcia w żelu są często przeprowadzane in vitro jednocześnie ze śladami DNazy , wydłużaniem starterów i eksperymentami z promotorem-sondą podczas badania inicjacji transkrypcji , replikacji zwojów DNA, naprawy DNA lub przetwarzania i dojrzewania RNA, a także splicingu pre-mRNA. Chociaż prekursory można znaleźć we wcześniejszej literaturze, większość obecnych testów opiera się na metodach opisanych przez Garnera i Revzina oraz Frieda i Crothersa .
Zasada
Test przesunięcia ruchliwości to elektroforetyczne rozdzielanie mieszaniny białko-DNA lub białko-RNA na żelu poliakryloamidowym lub agarozowym przez krótki czas (około 1,5-2 godziny dla żelu o długości od 15 do 20 cm). Szybkość, z jaką różne cząsteczki (i ich kombinacje) poruszają się w żelu, zależy od ich wielkości i ładunku oraz, w mniejszym stopniu, od ich kształtu (patrz elektroforeza żelowa ). Ścieżka kontrolna (sonda DNA bez obecności białka) będzie zawierała pojedynczy prążek odpowiadający niezwiązanemu fragmentowi DNA lub RNA. Jednakże, zakładając, że białko jest zdolne do wiązania się z fragmentem, ścieżka z obecnym białkiem, które się wiąże, będzie zawierać inny prążek reprezentujący większy, mniej mobilny kompleks sondy kwasu nukleinowego związany z białkiem, który jest „przesunięty” w górę na żelu (ponieważ poruszał się wolniej).
W odpowiednich warunkach eksperymentalnych interakcja między DNA (lub RNA) a białkiem jest stabilizowana, a stosunek kwasu nukleinowego związanego do niezwiązanego na żelu odzwierciedla frakcję wolnych i związanych cząsteczek sondy, gdy reakcja wiązania wchodzi do żelu. Ta stabilność jest częściowo spowodowana „efektem klatkowym”, polegającym na tym, że białko otoczone żelową matrycą nie jest w stanie dyfundować z sondy przed rekombinacją. Jeśli znane są wyjściowe stężenia białka i sondy oraz jeśli znana jest stechiometria kompleksu, można określić widoczne powinowactwo białka do sekwencji kwasu nukleinowego. O ile kompleks nie jest bardzo długo żyjący w warunkach żelowych lub nie bierze się pod uwagę dysocjacji podczas elektroforezy, otrzymana liczba jest pozorną Kd. Jeśli stężenie białka nie jest znane, ale stechiometria złożona jest, stężenie białka można określić, zwiększając stężenie sondy DNA, aż dalsze przyrosty nie zwiększą frakcji związanej z białkiem. Porównując z zestawem standardowych rozcieńczeń wolnej sondy przeprowadzonej na tym samym żelu, można obliczyć liczbę moli białka.
Warianty i dodatki
Do tej mieszaniny można dodać przeciwciało, które rozpoznaje białko, aby stworzyć jeszcze większy kompleks z większym przesunięciem. Metoda ta nazywana jest testem supershift i służy do jednoznacznej identyfikacji białka obecnego w kompleksie białko – kwas nukleinowy.
Często prowadzi się dodatkową ścieżkę z konkurencyjnym oligonukleotydem w celu określenia najkorzystniejszej sekwencji wiążącej dla białka wiążącego. Zastosowanie różnych oligonukleotydów o określonej sekwencji umożliwia identyfikację dokładnego miejsca wiązania przez współzawodnictwo (nie pokazano na schemacie). Warianty testu kompetycyjnego są przydatne do pomiaru specyficzności wiązania oraz do pomiaru kinetyki asocjacji i dysocjacji. Zatem EMSA może być również wykorzystana jako część eksperymentu SELEX do selekcji oligonukleotydów, które faktycznie wiążą dane białko. [ potrzebne źródło ]
Po określeniu wiązania DNA z białkiem in vitro , szereg algorytmów może zawęzić poszukiwania identyfikacji czynnika transkrypcyjnego. Oligonukleotydy o zgodnej sekwencji dla czynnika transkrypcyjnego będącego przedmiotem zainteresowania będą mogły konkurować o wiązanie, eliminując przesunięty prążek i muszą zostać potwierdzone przez superprzesunięcie. Jeśli przewidywana sekwencja konsensusowa nie współzawodniczy o wiązanie, identyfikację czynnika transkrypcyjnego może ułatwić multipleksowany konkurent EMSA (MC-EMSA), w którym duże zestawy sekwencji konsensusowych są multipleksowane w każdej reakcji i gdy jeden zestaw konkuruje o wiązanie, poszczególne sekwencje konsensusowe z tego zestawu są uruchamiane w dalszej reakcji.
Dla celów wizualizacji fragment kwasu nukleinowego jest zwykle znakowany znacznikiem radioaktywnym , fluorescencyjnym lub biotynowym . Standardowe bromkiem etydyny jest mniej czułe niż te metody i może nie wystarczyć do wykrycia kwasu nukleinowego, jeśli w tych doświadczeniach stosuje się niewielkie ilości kwasu nukleinowego lub jednoniciowego kwasu nukleinowego. W przypadku stosowania znacznika biotynowego do wykrywania fragmentu DNA stosuje się streptawidynę skoniugowaną z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa. Chociaż znakowanie izotopowe DNA ma niewielki wpływ lub nie ma żadnego wpływu na powinowactwo wiązania białka, użycie znaczników nieizotopowych, w tym fluoroforów lub biotyny, może zmienić powinowactwo i / lub stechiometrię interakcji białek będących przedmiotem zainteresowania. Konkurencja między sondą wyznakowaną fluoroforem lub biotyną a nieznakowanym DNA o tej samej sekwencji może być wykorzystana do określenia, czy znacznik zmienia powinowactwo wiązania lub stechiometrię.
