tagowanie MS2

Znakowanie MS2 jest techniką opartą na naturalnej interakcji białka płaszcza bakteriofaga MS2 ze strukturą łodygi-pętli z genomu faga , która jest wykorzystywana do biochemicznego oczyszczania kompleksów RNA-białko i współpracuje z GFP do wykrywania RNA w żywych komórkach. Niedawno technika ta została wykorzystana do monitorowania pojawiania się RNA w żywych komórkach, w miejscu transkrypcji lub po prostu poprzez obserwację zmian liczby RNA w cytoplazmie. To ujawniło, że transkrypcja zarówno genów prokariotycznych, jak i eukariotycznych zachodzi w sposób nieciągły serie transkrypcji oddzielone nieregularnymi przerwami.

Procedura

Rozpocznij od jednoniciowego RNA i utwórz wzór struktur pnia-pętli, dodając kopie sekwencji wiążących RNA MS2 do regionu niekodującego. Białko MS2 musi być połączone z GFP i połączone z mRNA, kompleksem zawierającym kopie sekwencji wiążącej RNA z MS2. Białko fuzyjne MS2-GFP wyrażano przez przeniesienie go do komórki z plazmidem (laboratorium Roberta Singera). Sygnał kodowany w RNA i obecność sygnału sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) w GFP-MS2 to dwa sygnały, które wprowadzają z kompleksów EGFP-MS2-RNA.

Oczyszczanie powinowactwa RNA znakowane biotyną MS2 (MS2-BioTRAP) jest jedną z metod in vivo identyfikacji interakcji białko-RNA. Ekspresjonowano zarówno RNA znakowany MS2, jak i znacznik białkowy MS2, a następnie wykorzystano interakcję powinowactwa, aby pomóc w procesie identyfikacji interakcji białko-RNA.

Zalety i wady

Zalety:

Metoda MS2-BioTRAP jest szybka, elastyczna i łatwa w konfiguracji; dobrze się skaluje i pozwala na badanie warunków fizjologicznych interakcji białko-RNA. Znacznik MS2 jest również skuteczny w przypadku małych cząsteczek, gdy białko otoczki MS2 jest stosowane do izolowania różnych cząstek rybonukleoprotein (RNP) .

Niedogodności:

Jedynym zastrzeżeniem znakowania MS2 jest to, że należy dodać wiele kopii pętli macierzystej MS2 wewnątrz RNA, aby wytworzyć wystarczający sygnał, aby zobaczyć i śledzić jedną cząsteczkę RNA w jądrze. Podczas śledzenia więcej niż jednej sekwencji RNA w jądrze hodowanych komórek, potrzebna jest więcej niż jedna sekwencja docelowa. Może na to wpływać białko MS2, które ma klasyczny podstawowy sygnał lokalizacji jądrowej (NLS), więc mogłoby to wpłynąć na lokalizację kompleksu RNA, a jądro miałoby większość GFP-MS2 (laboratorium Roberta Singera). Nagromadzenie GFP-MS2 w jądrze spowoduje silne sygnały fluorescencji jądrowej, które opóźnią lub uniemożliwią analizę lokalizacji jądrowej RNA, ponieważ utrudnią analizę splicingu, edycję RNA, jądrowy eksport RNA i translację RNA. Ponadto, w wyniku dodania znacznika, drugorzędowa struktura RNA może wprowadzić artefakt.

Ponadto znacznik MS2 będzie miał wpływ na poziomy ekspresji małego niekodującego RNA (sRNA) i właściwości regulacyjne. Ponadto, używając MS2 jako znacznika powinowactwa do oczyszczania białka w bakteriach E. coli , naukowcy wyrazili MS2-MBP, które jest białkiem płaszcza MS2 niosącym mutacje połączone z białkami wiążącymi maltozę . Mutacje zapobiegały oligomeryzacji .