test HUMARA
Test HUMARA jest jedną z najczęściej stosowanych metod określania klonalnego pochodzenia guza. Metoda opiera się na inaktywacji chromosomu X i wykorzystuje inny status metylacji genu o nazwie HUMARA (skrót od ludzkiego receptora androgenowego ), który znajduje się na chromosomie X. Biorąc pod uwagę fakt, że po inaktywacji jednego chromosomu X w komórce, wszystkie inne pochodzące od niego komórki będą miały dezaktywowany ten sam chromosom X, podejście to staje się doskonałym narzędziem do różnicowania komórek monoklonalnych populacji z poliklonalnej w tkance żeńskiej. W szczególności gen HUMARA ma trzy ważne cechy, które czynią go bardzo wygodnym do tego celu.
1-) Gen znajduje się na chromosomie X i przechodzi inaktywację przez metylację w normalnej embriogenezie niemowlęcia płci żeńskiej. Fakt, że większość - ale nie wszystkie - genów na chromosomie X ulega inaktywacji, ta cecha staje się ważna.
2-) Allele genów ludzkiego receptora androgenowego mają różną liczbę powtórzeń CAG. Tak więc, gdy DNA ze zdrowej tkanki żeńskiej jest powielane metodą PCR dla określonego regionu genu, na żelu można zobaczyć dwa oddzielne prążki.
3-) Region amplifikowany przez PCR ma również pewne rzędy zasad, które czynią go podatnym na trawienie przez enzym HpaII (lub Hhal), gdy nie jest metylowany. Ten szczegół daje badaczom możliwość odróżnienia allelu metylowanego od allelu niemetylowanego.
Dzięki tym właściwościom genu HUMARA można określić pochodzenie klonalne dowolnej tkanki z organizmu samicy ssaka.
Podstawowy proces jest wykonywany w następujący sposób:
1-) DNA z tkanki jest izolowane.
2-) Wyizolowany DNA traktuje się odpowiednim enzymem (takim jak HpaII) w optymalnych warunkach przez sugerowany czas (tj. przez noc).
3-) DNA jest oczyszczane, a określony region genu HUMARA jest amplifikowany metodą PCR przy użyciu „odpowiednich” starterów (na przykład patrz: Ref.2)
4-) Po przepuszczeniu produktów PCR przez żel, żel wizualizuje się i odpowiednio analizuje wyniki. Jeśli widoczne są dwa prążki, badana tkanka jest najprawdopodobniej pochodzenia poliklonalnego. Jeśli obserwuje się pojedynczy prążek, tkanka jest monoklonalna, chyba że dwa allele mają dokładnie taką samą liczbę powtórzeń CAG lub różne komórki z tym samym inaktywowanym nowotworem; więc pozornie monoklonalny, chociaż w rzeczywistości jest poliklonalny.
Aby wyciągnąć wnioski na temat klonalności nowotworu, najlepiej jest użyć DNA z normalnej tkanki tej samej osoby, a próbkę nietraktowaną enzymem należy również zamplifikować jako kontrolę. Jeśli nawet w normalnych tkankach bez obróbki enzymatycznej obserwuje się pojedynczy prążek, można to wyjaśnić w następujący sposób; ta osoba ma wzór genetyczny jako XO (tę możliwość można wykluczyć, aby zobaczyć prążek po obróbce enzymem, ponieważ jeśli rzeczywiście XO jest wzorem genetycznym próbki, to NIE będzie metylacji, dlatego żaden prążek nie powinien być widoczny po trawieniu W przypadku zobaczenia prążka po leczeniu enzymem, obserwacja najprawdopodobniej oznacza, że dana osoba ma dwa chromosomy X z dokładnymi powtórzeniami CAG.) Kiedy widzisz dwa prążki dla prawidłowej tkanki (zarówno poddanej działaniu enzymu, jak i nie poddanej działaniu) , i widzisz dwa prążki dla próbki guza traktowanego enzymem, ale dwa prążki dla nieleczonego DNA nowotworu, to z pewnością patrzysz na guz poliklonalny. Jeśli jednak widzisz tę samą liczbę prążków tylko z jednym prążkiem po leczeniu enzymem, istnieje dość duże prawdopodobieństwo, że guz będący przedmiotem twojego zainteresowania jest monoklonalny. W tym ostatnim przypadku monoklonalność nie jest pewna, ponieważ, jak wspomniano wcześniej, istnieje możliwość posiadania dokładnie takich samych powtórzeń -CAG- na obu allelach.