transpozon Tn3

Transpozon Tn3 jest ruchomym elementem genetycznym o długości 4957 par zasad , występującym u prokariotów . Koduje trzy białka:

• β-laktamaza , enzym nadający oporność na antybiotyki β-laktamowe (kodowany przez gen Bla).
• Transpozaza Tn3 (kodowana przez gen tnpA)
• Resolwaza Tn3 (kodowana przez gen tnpR)

Początkowo odkryta jako represor transpozazy, resolwaza odgrywa również rolę w ułatwianiu replikacji Tn3 (Sherratt 1989).

Transpozon jest otoczony parą odwróconych powtórzeń o długości 38 pz.

Mechanizm replikacji

Integracja replikacyjna. Niebieska strzałka = transpozon, zielony trójkąt = miejsce rozpoznawane przez endonukleazę

Krok 1 – Integracja replikacyjna

Ten pierwszy etap jest katalizowany przez transpozazę.

Plazmid zawierający transpozon (plazmid donorowy) łączy się z plazmidem gospodarza (plazmid docelowy). W tym procesie replikowany jest transpozon i krótki odcinek DNA gospodarza. Produktem końcowym jest „skointegrowany” plazmid zawierający dwie kopie transpozonu.

Shapiro (1978) zaproponował następujący mechanizm tego procesu:

1. Następują cztery cięcia pojedynczej nici - jedno na każdej nici plazmidu donorowego i jedno na każdej nici plazmidu docelowego.
2. Plazmidy donorowe i docelowe są połączone razem, ale istnieją dwa regiony jednoniciowe, ze względu na położenie pierwotnych cięć.
3. Replikacja DNA powoduje, że jednoniciowe regiony stają się dwuniciowe, wykorzystując istniejącą nić jako matrycę. Na tym etapie następuje replikacja transpozonu.
   

   Uwaga Diagram nie jest pomyślany jako dokładne przedstawienie struktury 3D.

Diagramy po prawej ilustrują sposób, w jaki pozycje cięć prowadzą do replikacji pewnych regionów po fuzji plazmidów.

Krok 2 – Rozdzielczość

Reakcja katalizowana przez resolwazę Tn3

Aby oddzielić cząsteczki gospodarza i cząsteczki docelowej, resolwaza Tn3 przeprowadza specyficzną dla miejsca rekombinację między starą i nową kopią transpozonu w określonym miejscu zwanym res , które jest obecne w każdej kopii transpozonu. Rez ma długość 114 pz i składa się z 3 podobszarów, mianowicie stanowisk I, II i III. Każde z tych miejsc ma różną długość (odpowiednio 28, 34 i 25 pz) i są one rozmieszczone nierównomiernie z 22 pz oddzielającymi miejsca I i II i tylko 5 pz między miejscami II i III. Miejsca składają się z odwróconych motywów powtórzeń o długości 6 pz otaczających centralną sekwencję o zmiennej długości. Motywy te działają jako miejsca wiązania rezolwazy, tak że każde miejsce wiąże dimer rezolwazy, ale z różnym powinowactwem i prawdopodobnie nieco inną architekturą kompleksu białko-DNA. Wszystkie trzy podstrony są niezbędne do rekombinacji.

Podczas rekombinacji dwa bezpośrednio powtarzające się miejsca res z dimerami resolwazy związanymi z każdym podmiejscem łączą się, tworząc dużą złożoną strukturę zwaną synaptosomem. Resolwaza związana z miejscami II i III inicjuje składanie tego kompleksu. W tej strukturze, której dokładna architektura jest nadal niejasna, dwa miejsca res są splecione w taki sposób, że zestawiają ze sobą dwie kopie miejsca I, umożliwiając dimerom resolwazy związanym z każdym miejscem utworzenie tetrameru. Ponownie, to interakcja między dimerami resolwazy związanymi w miejscach dodatkowych (miejsca II i III) a rezolwazą w miejscu I powoduje, że dwa dimery łączą się w synapsy i tworzą tetramer. Po utworzeniu tetrameru zostaje on aktywowany, a górna i dolna nić DNA są jednocześnie cięte w środku miejsca I z wystającym fragmentem 2 pz. Wymiana nici następuje za pomocą nieznanego jeszcze mechanizmu, z wynikającym z tego obrotem netto o 180°. Po wymianie nici następuje religacja (Stark i in., 1992). Rekombinacja między dwoma bezpośrednio powtórzonymi miejscami res rozdziela lub rozdziela „kointegrację” na dwie oryginalne cząsteczki, z których każda zawiera teraz kopię transpozonu Tn3. Po rozdzieleniu te dwie cząsteczki pozostają połączone jako prosty dwuwęzłowy katenan, który można łatwo rozdzielić in vivo przez topoizomerazę typu II (Grindley 2002). System resolwazy typu dzikiego bezwzględnie wymaga superskręconego substratu i miejsc rekombinacji zorientowanych w bezpośrednim powtórzeniu na tej samej cząsteczce DNA. Jednak wyizolowano pewną liczbę „rozregulowanych” lub „nadpobudliwych” mutantów, które utraciły wymagania dotyczące miejsc dodatkowych. Te mutanty są zdolne do katalizowania rekombinacji tylko między dwiema kopiami miejsca I, co zasadniczo zmniejsza rozmiar miejsca rekombinacji z 114 pz do zaledwie 28 pz. Co więcej, te mutanty nie mają superskręcenia lub wymagania dotyczące łączności (Arnold i in., 1999) i wykazano, że działają w komórkach ssaków. Hiperaktywne mutanty resolwazy okazały się jak dotąd przydatne w tworzeniu resolwaz o zmienionej specyficzności sekwencji, ale także w pracach strukturalnych.

Całą reakcję rekombinacji rezolwazy można odtworzyć in vitro , wymagając jedynie rezolwazy, substratu DNA i wielowartościowych kationów, przy użyciu białka typu dzikiego lub hiperaktywnych mutantów.

Hiperaktywne mutanty resolwazy, jeśli będą dalej rozwijane, mogą stać się alternatywą dla Cre i FLP , najczęściej stosowanych dotychczas systemów rekombinacji w biologii molekularnej.

• Sherratt, DJ (1989). Tn3 i powiązane elementy transpozycyjne: rekombinacja i transpozycja specyficzna dla miejsca. W Berg, DE, Howe, M. (red.) Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, DC, s. 163–184
• Grindley, NDF (2002). Ruch elementów typu Tn3: transpozycja i rozdzielczość kointegracji. W Mobile DNA II, Craig, N., Craigie, R., Gellert, M. i Lambowitz, A. (red.), s. 272–302. ASM Press, Waszyngton, DC, USA