Rekombinacja FLP-FRT

Szukaj
Struktury	Model szwajcarski
Domeny	InterPro

rekombinazy Flp
identyfikatory
rekombinazy Flp
Organizm	Saccharomyces cerevisiae
Symbol	FLP1
UniProt	P03870
Struktury
Szukaj
Struktury	Model szwajcarski
Domeny	InterPro

W genetyce rekombinacja Flp- FRT jest technologią rekombinacji ukierunkowanej , coraz częściej wykorzystywaną do manipulowania DNA organizmu w kontrolowanych warunkach in vivo . Jest ona analogiczna do rekombinacji Crelox FRT , ale obejmuje rekombinację sekwencji pomiędzy miejscami docelowymi rozpoznawanymi przez krótkie flippazy ( ) przez rekombinazę flippazy ( Flp ) pochodzącą z 2 µ plazmidu drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae .

Minimalna sekwencja miejsca FRT o wielkości 34 pz ma sekwencję

^5' GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC ^3'

dla którego flippaza (Flp) wiąże się z obydwoma ramionami 5'-GAAGTTCCTATTC-3' o długości 13 pz, flankującymi odstępnik o długości 8 pz, tj. rekombinacja specyficzna dla miejsca (region krzyżowania) w odwrotnej orientacji. Rozszczepienie, w którym pośredniczy FRT , następuje tuż przed asymetrycznym regionem rdzenia 8 pz ( ^5' tctagaaa ^3' ) na nici górnej i za tą sekwencją na nici dolnej. Istnieje kilka wariantów FRT , ale rekombinacja może zwykle zachodzić tylko między dwoma identycznymi FRT , ale na ogół nie między nieidentycznymi („heterospecyficznymi”) FRT .

Funkcja biologiczna

U drożdży enzym ten koryguje spadek liczby kopii plazmidu 2 µ spowodowany rzadkimi błędami segregacji. Czyni to powodując rekombinację między dwoma odwróconymi powtórzeniami na plazmidzie 2 µ podczas replikacji DNA . Zmienia to kierunek jednego rozwidlenia replikacji, powodując wiele rund kopiowania w jednej inicjacji.

Mutacje sekwencji miejsca FRT

Senecoff i in. (1987) zbadali, w jaki sposób substytucje nukleotydów w obrębie FRT wpłynęły na skuteczność rekombinacji, w której pośredniczy FLP. Autorzy wywołali substytucje zasad w jednym lub obu miejscach FRT i przetestowali stężenie FLP wymagane do zaobserwowania rekombinacji specyficznych dla miejsca. Każde podstawienie zasady przeprowadzono na każdym z trzynastu nukleotydów w miejscu FRT (przykład G na A, T i C). Po pierwsze, autorzy wykazali, że większość mutacji w obrębie sekwencji FRT powoduje minimalne skutki, jeśli występuje tylko w jednym z dwóch miejsc. Jeśli mutacje wystąpiły w obu miejscach, wydajność FLP jest dramatycznie zmniejszona. Po drugie, autorzy dostarczyli danych, dla których nukleotydów są najbardziej istotne dla wiązania FLP i skuteczności rekombinacji specyficznej dla miejsca. Jeśli pierwszy nukleotyd w obu miejscach FRT jest podstawiony cytozyną (G do C), trzeci nukleotyd jest podstawiony tyminą (A do T) lub siódmy nukleotyd jest podstawiony adenozyną (G do A), wtedy skuteczność rekombinacji specyficznej dla miejsca, w której pośredniczy FLP, jest zmniejszona ponad 100-krotnie. Podczas gdy podstawienie zasadą któregokolwiek z wyżej wymienionych nukleotydów tylko w jednym z miejsc FRT prowadziło odpowiednio do dziesięciokrotnego, dziesięciokrotnego i pięciokrotnego zmniejszenia skuteczności.

Podstawienia zasad w nukleotydach pisanych wielką literą doprowadziły do największego zmniejszenia rekombinacji specyficznej dla miejsca, w której pośredniczy FLP (mutant typu dzikiego x i mutant mutanta x):

^5' GaAtagGaacttc ^3'

Wiele dostępnych konstruktów zawiera dodatkowe sekwencje ramion (5'- GAAGTTCCTATTCC -3') o jedną parę zasad dalej od elementu znajdującego się powyżej iw tej samej orientacji:

^5' GAAGTTCCTATTC c GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC ^3'

Ten segment jest zbędny do wycięcia, ale niezbędny do integracji, w tym wymiany kaset za pośrednictwem rekombinazy .

Ponieważ aktywność rekombinacji może być ukierunkowana na wybrany narząd lub niski poziom aktywności rekombinacji może być zastosowany do konsekwentnej zmiany DNA tylko podzbioru komórek, Flp-FRT można stosować do konstruowania genetycznych mozaik w organizmach wielokomórkowych. Za pomocą tej technologii można badać utratę lub zmianę genu w danym narządzie docelowym, nawet w przypadkach, gdy zwierzęta doświadczalne nie przeżyłyby utraty tego genu w innych narządach (kontrola przestrzenna ) . Efekt zmiany genu można również badać w czasie, stosując indukowalny promotor do wyzwalania aktywności rekombinacyjnej na późnym etapie rozwoju ( kontrola czasowa ) - zapobiega to zmianie.

Budowa biochemiczna Flp i mechanizm działania

Biochemicznie istotna struktura i miejsce aktywne

Białko Flp, podobnie jak Cre, jest specyficzną rekombinazą z rodziny tyrozyn. Ta rodzina rekombinaz spełnia swoją funkcję poprzez mechanizm topoizomerazy typu IB powodujący rekombinację dwóch oddzielnych nici DNA. Rekombinację przeprowadza się w powtarzanym procesie dwuetapowym. Początkowy krok powoduje utworzenie złącza Holliday . Drugi etap promuje wynikową rekombinację dwóch komplementarnych nici. Jak sugeruje ich nazwisko rodowe, wysoce konserwatywny nukleofil tyrozynowy rozszczepia nici DNA. Nukleofilowe właściwości tyrozyny atakują i wiążą się z 3'-fosforanem w miejscu rozszczepienia DNA. Powstała grupa 5'-hydroksylowa rozszczepionego DNA działa jak nukleofil i atakuje 3'-fosforan na komplementarnie rozszczepionej nici DNA, co skutkuje pomyślną rekombinacją. Poza resztą tyrozyny znajduje się konserwowana pentada katalityczna. Ta pentada składa się z lizyny (Lysβ), dwóch arginin (Arg I i II), histydyny (His-II) i histydyny/tryptofanu (His/Trp-III), która zawiera obowiązkową i wysoce konserwatywną konstelację reszty dla miejsca aktywnego Flp i Cre (wraz z innymi topiosomerazami IB). Te inne reszty są kluczowe dla prawidłowej orientacji wiązania i pozycjonowania Flp na niciach DNA.

Zastosowanie rekombinacji specyficznej dla miejsca za pośrednictwem FLP

Początkowe problemy

termolabilność

Początkowe zastosowanie rekombinazy FLP-FRT nie zadziałało u ssaków. Białko FLP było termolabilne (denaturowane w podwyższonych temperaturach) i dlatego nie było przydatne w modelu ssaczym ze względu na podwyższoną temperaturę ciała tych układów modelowych. Jednak ze względu na patenty i ograniczenia w stosowaniu rekombinacji Cre-Lox, duże zainteresowanie wzbudziło wyprodukowanie bardziej termostabilnej kasety FLP-FRT. Niektóre z pierwszych wyników zostały opracowane przez Buchholza i in. (1997) wykorzystując cykliczną mutagenezę w Escherichia coli . W swoich badaniach autorzy transfekowali komórki E. coli dwoma plazmidami: jednym kodującym losowo zmutowane białka FLP poniżej promotora arabinozy i drugim zawierającym promotor genu lacZ w kasecie FRT. E. coli hodowano na płytkach z arabinozą w 37°C i 40°C, a jeśli nastąpiła rekombinacja, ekspresja lacZ byłaby osłabiona, a kolonie wydawałyby się białe. Z każdego pokolenia wybierano białe kolonie i hodowano je na nowych płytkach z arabinozą w tych samych poprzednich temperaturach przez osiem pokoleń. Po potwierdzeniu rekombinacji metodą Western blotting i zsekwencjonowaniu zmutowanych genów FLP, to FLP ósmej generacji (FLPe) transfekowano do hodowli komórek ssaków i potwierdzono rekombinację w komórkach ssaków. Ten wariant FLP ma tylko 4 podstawienia aminokwasów: P2S, L33S, Y108N i S294P.

Generowanie mozaik genetycznych

Mozaicyzm genetyczny występuje w organizmie, gdy podobne typy komórek wyrażają różne fenotypy z powodu odmiennych genotypów w określonych loci. Mówiąc najprościej, dzieje się tak, gdy jeden organizm zawiera różne genotypy, co jest zwykle rzadkie w przyrodzie. Można to jednak łatwo (i problematycznie) wytworzyć za pomocą rekombinacji FLP-FRT. Jeśli w komórce obecne są dwa różne miejsca FRT, a FLP jest obecny w odpowiednich stężeniach, kaseta FRT będzie nadal wycinana i wstawiana pomiędzy dwa miejsca FRT. Proces ten będzie kontynuowany, dopóki białka FLP nie spadną poniżej wymaganych stężeń, co spowoduje, że komórki w organizmie będą miały różne genotypy. Zaobserwowano to od muszek owocówek po myszy i jest to bezkrytyczne w odniesieniu do określonych chromosomów (somatycznych i płciowych) lub typów komórek (somatycznych i linii zarodkowych).

Oznaczanie linii komórkowych

Przed publikacją Dymecki et al . (1998), rekombinaza Cre została wykorzystana do mapowania losów komórkowych prekursorów neuronów u myszy przy użyciu En2 . Tak więc autorzy Dymecki et al . (1998) wysunęli teorię, że rekombinazę FLP można wykorzystać w podobny sposób z podobną skutecznością jak rekombinaza Cre u myszy. Autorzy stworzyli dwie transgeniczne linie myszy: linię fuzji neuronalnej Wnt1::Flp i linię, która posiadała kasetę FRT flankującą 18 ekson tm1Cwr . Autorzy wybrali ten ekson do wycięcia, ponieważ jeśli zostanie wycięty, skutkuje to fenotypem zerowym. Autorzy połączyli dwie linie i pozwolili potomstwu osiągnąć dojrzałość, zanim potomstwo zostało uśmiercone. Ekstrakcję RNA przeprowadzono z tkanki nerwowej, mięśniowej, jelitowej i ogonowej. PCR z odwrotną transkrypcją i metoda Northern blotting potwierdziły obficie wycięcie eksonu 18. tm1Cwr w tkance mózgowej i umiarkowanie w tkance mięśniowej (z powodu komórek Scwhanna w mięśniu). Zgodnie z oczekiwaniami, wycięcia nie zaobserwowano w innych tkankach. Autorzy stwierdzili taką samą, jeśli nie lepszą, skuteczność rekombinazy FLP w określaniu losu komórki niż rekombinazy Cre.

U Drosophila melanogaster (muszka owocowa)

Do tej pory rekombinaza Flp była wielokrotnie wykorzystywana w D. melanogaster. Porównanie rekombinazy Flp z rekombinazą Cre u D. melanogaster zostało opublikowane przez Frickenhaus i in. (2015) . Autorzy Frickenhaus i in. (2015) mieli dwojaki cel: scharakteryzować i porównać skuteczność „knock-out” rekombinazy Flp z „knock-out” rekombinazy Cre i knockdown RNAi oraz ujawnić funkcję cabeza (caz), ortologa muchy do FUS , w neuronach i tkance mięśniowej D. melanogaster . FUS jest silnie zaangażowany w stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i otępienie czołowo-skroniowe u ludzi . Autorzy wykorzystali system elav - Gal4/UAS -Flp lub Cre do ekspresji rekombinazy specyficznie w neuronach oraz system Mef2 -Gal4/UAS-Flp lub Cre do ekspresji jej specyficznie w mięśniach. Autorzy doszli do wniosku, że narzędzie „knock-out” rekombinazy Flp jest skuteczniejsze niż zarówno rekombinaza RNAi, jak i rekombinaza Cre w celu wyeliminowania określonych genów w określonych tkankach lub liniach komórkowych z powodu braku nieszczelnej ekspresji obserwowanej zarówno w białku Cre i transkryptu RNAi. Ponadto autorzy byli świadkami toksyczności białka Cre, której nie obserwuje się w przypadku białka Flp.

W Danio rerio (danio pręgowany)

Skuteczność systemu rekombinazy FLPe została oceniona u danio pręgowanego przez Wong i in . (2009). Zarodki, które były hemizygotyczne dla flankowanego przez FRT białka wzmocnionej zielonej fluorescencji (EGFP) poniżej promotora specyficznego dla mięśni, wstrzyknięto białkiem FLPe. Bez FLPe zarodki te powinny wykazywać ekspresję EGFP we wszystkich tkankach mięśniowych, a po skrzyżowaniu z nicią typu dzikiego 50% powstałego potomstwa powinno również wykazywać ekspresję EGFP w tkance mięśniowej. Zarodki, którym wstrzyknięto FLPe, miały znacznie zmniejszoną ekspresję EGFP w tkance mięśniowej, zaobserwowano również mozaicyzm. Kiedy te zarodki osiągnęły dojrzałość, zostały skojarzone ze szczepem typu dzikiego, a powstałe lęgi miały znacznie mniej potomstwa, które eksprymowało EGFP w tkance mięśniowej (0-4%). Wyniki te pokazują, że FLPe jest nie tylko wysoce skuteczny w komórkach somatycznych, ale także w linii zarodkowej danio pręgowanego.

W roślinach

Tworzenie „fitosensorów” lub „strażników” u Arabidopsis thaliana i tytoniu

Fitosensory to genetycznie zmodyfikowane rośliny, które mogą zgłaszać obecność zanieczyszczeń biotycznych lub abiotycznych. Oczywiście produkcja tych zmodyfikowanych roślin jest bardzo obiecująca dla rolnictwa i laboratoriów. Jednak stworzenie odpowiedniego wektora reporterowego okazało się problematyczne. cis odgrywają główną rolę w transkrypcyjnej aktywacji genów w roślinach, a wiele z nich nie jest dobrze poznanych. Wiele fitosensorów albo nie wyraża swoich genów reporterowych, albo zgłasza fałszywie dodatnie wyniki z powodu syntetycznych promotorów. Autorzy Rao i in. (2010) wykorzystali narzędzie rekombinazy FLP do produkcji wysoce wydajnych fitosensorów. Autorzy użyli promotora szoku cieplnego do indukcji produkcji FLP, podczas gdy wektor flankowany FRT oddzielał promotor CaMV 35S od genu beta-glukuronidazy (GUS). Gdy rośliny były narażone na szok termiczny, indukcja FLP doprowadziła do wycięcia wektora flankowanego FRT, skutecznie przesuwając gen GUS bezpośrednio w dół od promotora CaMV 35S. Aktywacja GUS doprowadziła do zmiany liści roślin z zielonego na niebieski; w ten sposób fitosensor skutecznie zgłaszał stres do systemu modelowego!

Z rekombinazą Cre

Wytwarzanie systemu ekspresyjnego indukowalnego MiRNA (GRIM) gotowego do użycia w bramce

Interferencja RNA (RNAi) spowodowała zmianę paradygmatu w ekspresji genów i potencjalne nokauty genów u eukariontów. Przed wyprodukowaniem systemu ekspresyjnego GRIM tworzenie wektorów RNAi było kosztowne i czasochłonne. Wektory wytworzono tradycyjną metodą klonowania molekularnego typu „kopiuj i wklej”. Garwick-Coppens i in . (2011) opracowali znacznie wydajniejszą metodę produkcji wektorów RNAi, w której ekspresja RNAi może zostać włączona przy użyciu rekombinazy Cre i wyłączona przy użyciu rekombinazy Flp. Nowatorski GRIM Expression System pozwala na znacznie szybsze generowanie wektorów ekspresyjnych zawierających sztuczne konstrukty RNAi. Autorzy wykazali następnie, że ich system ekspresyjny działa dość skutecznie w komórkach ludzkich embrionalnych nerek (HEK), typowej ludzkiej unieśmiertelnionej linii komórkowej w badaniach molekularnych.

Zobacz też

Linki zewnętrzne