Rekombinacja specyficzna dla miejsca
Rekombinacja specyficzna dla miejsca , znana również jako konserwatywna rekombinacja specyficzna dla miejsca , jest rodzajem rekombinacji genetycznej , w której zachodzi wymiana nici DNA między segmentami posiadającymi co najmniej pewien stopień homologii sekwencji . Enzymy znane jako rekombinazy specyficzne dla miejsca (SSR) dokonują rearanżacji segmentów DNA poprzez rozpoznawanie i wiązanie się z krótkimi, specyficznymi sekwencjami (miejscami) DNA, w których rozszczepiają szkielet DNA, wymieniają dwie zaangażowane helisy DNA i ponownie łączą nici DNA. W niektórych przypadkach obecność enzymu rekombinazy i miejsc rekombinacji jest wystarczająca do zajścia reakcji; w innych systemach wymagana jest pewna liczba białek pomocniczych i/lub miejsc dodatkowych. Wiele różnych strategii modyfikacji genomu , w tym wymiana kaset za pośrednictwem rekombinazy (RMCE), zaawansowane podejście do ukierunkowanego wprowadzania jednostek transkrypcyjnych do z góry określonych loci genomowych, opiera się na SSR.
Systemy rekombinacji specyficznej dla miejsca są wysoce specyficzne, szybkie i wydajne, nawet w obliczu złożonych genomów eukariotycznych . Są one naturalnie wykorzystywane w różnych procesach komórkowych, w tym w replikacji genomu bakteryjnego , różnicowaniu i patogenezie oraz przemieszczaniu ruchomych elementów genetycznych . Z tych samych powodów stanowią one potencjalną podstawę do rozwoju inżynierii genetycznej .
Miejsca rekombinacji mają zazwyczaj długość od 30 do 200 nukleotydów i składają się z dwóch motywów z częściową symetrią odwróconych powtórzeń, z którymi wiąże się rekombinaza i które flankują centralną sekwencję krzyżowania, w której zachodzi rekombinacja. Pary miejsc, pomiędzy którymi zachodzi rekombinacja, są zwykle identyczne, ale zdarzają się wyjątki (np. attP i attB integrazy λ ).
rekombinazy tyrozyny vs. seryny
Ryc. 1. Rekombinazy Tyr: szczegóły etapu krzyżowania. U góry: widok tradycyjny, w tym wymiana nici, po której następuje migracja gałęzi (korekta). Mechanizm zachodzi w ramach kompleksu synaptycznego (1) obejmującego oba miejsca DNA w równoległej orientacji. Chociaż migracja rozgałęzień wyjaśnia specyficzne wymagania dotyczące homologii i odwracalności procesu w prosty sposób, nie można jej pogodzić z ruchami, którym podjednostki rekombinazy muszą podlegać w trzech wymiarach. Dół: aktualny widok. Dwie jednoczesne zamiany nici, każda w zależności od komplementarności trzech kolejnych zasad na (lub w pobliżu) krawędzi przekładki 8-bp (linie przerywane wskazują parowanie zasad). Komplikacje dydaktyczne wynikają z faktu, że w tym modelu kompleks synaptyczny musi pomieścić oba substraty w orientacji antyrównoległej.
Ten kompleks synaptyczny (1) powstaje w wyniku połączenia dwóch indywidualnych podjednostek rekombinazy („protomerów”; szare owale) z odpowiednim miejscem docelowym. Jego powstawanie zależy od kontaktów międzyprotomerowych i wygięcia DNA, które z kolei definiują podjednostki (kolor zielony) odgrywające aktywną rolę podczas pierwszej reakcji krzyżowania. Obie reprezentacje ilustrują tylko połowę odpowiedniej ścieżki. Części te oddziela się etapem łączenia/izomeryzacji Hollidaya, zanim produkt (3) będzie mógł zostać uwolniony.
Ryc. 2. Ser-rekombinazy: (zasadniczo nieodwracalny) szlak rotacji podjednostek. W przeciwieństwie do rekombinaz Tyr, cztery uczestniczące nici DNA są cięte synchronicznie w punktach przesuniętych tylko o 2 pz (pozostawiając niewiele miejsca na korektę). Obrót podjednostki (180°) umożliwia wymianę nici, gdy są one kowalencyjnie połączone z partnerem białkowym. Pośrednia ekspozycja pęknięć dwuniciowych niesie ze sobą ryzyko wywołania nielegalnej rekombinacji, a tym samym reakcji wtórnych.
Tutaj kompleks synaptyczny powstaje w wyniku asocjacji wstępnie utworzonych dimerów rekombinazy z odpowiednimi miejscami docelowymi (CTD/NTD, domena C-/N-końcowa). Podobnie jak w przypadku rekombinaz Tyr, każde miejsce zawiera dwa ramiona, z których każde zawiera jeden protomer. Ponieważ oba ramiona mają nieco inną strukturę, podjednostki zostają dostrojone konformacyjnie, a tym samym przygotowane do ich odpowiedniej roli w cyklu rekombinacji. W przeciwieństwie do członków klasy Tyr, szlak rekombinacji przekształca dwa różne miejsca substratów (attP i attB) w hybrydy miejsc (attL i attR) . To wyjaśnia nieodwracalną naturę tej konkretnej ścieżki rekombinacji, którą można przezwyciężyć jedynie za pomocą pomocniczych „czynników kierunkowości rekombinacji” (RDF).
Na podstawie homologii sekwencji aminokwasów i pokrewieństwa mechanistycznego większość rekombinaz specyficznych dla miejsca jest pogrupowana w jedną z dwóch rodzin: rodzinę rekombinaz tyrozynowych (Tyr) lub rodzinę rekombinaz serynowych (Ser) . Nazwy wywodzą się od konserwatywnych nukleofilowych reszt aminokwasowych obecnych w każdej klasie rekombinaz, które są używane do atakowania DNA i które łączą się z nim kowalencyjnie podczas wymiany nici. Najwcześniej zidentyfikowani członkowie rodziny rekombinaz serynowych byli znani jako resolwazy lub inwertazy DNA, podczas gdy członek-założyciel rekombinaz tyrozynowych, fag lambda integraza (wykorzystująca miejsca rozpoznawania attP/B), różni się od znanych obecnie enzymów, takich jak Cre (z faga P1 ) i FLP (z drożdży Saccharomyces cerevisiae ). Słynne rekombinazy serynowe obejmują enzymy, takie jak resolwaza gamma-delta (z transpozonu Tn 1000 ), resolwaza Tn3 (z transpozonu Tn3) i integraza φ C31 (z faga φ C31).
Chociaż poszczególni członkowie dwóch rodzin rekombinaz mogą przeprowadzać reakcje z takimi samymi praktycznymi wynikami, rodziny te nie są ze sobą spokrewnione, mają różne struktury białek i mechanizmy reakcji. W przeciwieństwie do rekombinaz tyrozynowych, rekombinazy serynowe są wysoce modułowe, jak po raz pierwszy zasugerowano w badaniach biochemicznych, a później wykazano za pomocą struktur krystalograficznych. Znajomość tych struktur białkowych może okazać się przydatna podczas próby przeprojektowania białek rekombinazy jako narzędzi do manipulacji genetycznych.
Mechanizm
Rekombinacja między dwoma miejscami DNA rozpoczyna się od rozpoznania i związania tych miejsc – po jednym miejscu na każdej z dwóch oddzielnych dwuniciowych cząsteczek DNA lub co najmniej dwóch odległych segmentów tej samej cząsteczki – przez enzym rekombinazę. Następnie następuje synapsa , czyli połączenie miejsc w kompleks synaptyczny. To właśnie w tym kompleksie synaptycznym zachodzi wymiana nici, ponieważ DNA jest rozszczepiane i ponownie łączone w kontrolowanych transestryfikacji . Podczas wymiany nici każda dwuniciowa cząsteczka DNA jest przecinana w stałym punkcie w regionie krzyżowania się miejsca rozpoznawania, uwalniając grupę hydroksylową dezoksyrybozy , podczas gdy enzym rekombinaza tworzy przejściowe wiązanie kowalencyjne z fosforanem szkieletu DNA . To wiązanie fosfodiestrowe między grupą hydroksylową nukleofilowej reszty seryny lub tyrozyny zachowuje energię, która została zużyta na rozszczepienie DNA. Energia zmagazynowana w tym wiązaniu jest następnie wykorzystywana do ponownego łączenia DNA z odpowiednią grupą hydroksylową dezoksyrybozy na drugiej cząsteczce DNA. Cała reakcja przebiega zatem bez potrzeby stosowania zewnętrznych, bogatych w energię kofaktorów takie jak ATP .
Chociaż podstawowa reakcja chemiczna jest taka sama dla rekombinaz tyrozynowych i serynowych, istnieją między nimi pewne różnice. Rekombinazy tyrozynowe, takie jak Cre lub FLP , rozszczepiają po jednej nici DNA na raz w punktach, które są przesunięte o 6–8 pz, łącząc koniec 3' nici z grupą hydroksylową nukleofila tyrozynowego (ryc. 1). Wymiana nici przebiega następnie przez skrzyżowane pasmo pośrednie, analogiczne do złącza Hollidaya , w którym wymieniono tylko jedną parę pasm.
Mechanizm i kontrola rekombinaz serynowych są znacznie słabiej poznane. Ta grupa enzymów została odkryta dopiero w połowie lat 90. XX wieku i nadal jest stosunkowo niewielka. Obecnie klasyczni członkowie resolwazy gamma-delta i Tn3 , ale także nowe dodatki, takie jak integrazy φC31-, Bxb1- i R4, przecinają wszystkie cztery nici DNA jednocześnie w punktach, które są przesunięte o 2 pz (ryc. 2). Podczas rozszczepienia wiązanie białko-DNA powstaje w wyniku transestryfikacji , w której wiązanie fosfodiestrowe jest zastąpione wiązaniem fosfoserynowym między fosforanem 5' w miejscu rozszczepienia a grupą hydroksylową konserwowanej reszty seryny (S10 w resolwazie).
Nadal nie jest do końca jasne, w jaki sposób następuje wymiana nici po rozszczepieniu DNA. Jednak wykazano, że nici są wymieniane, gdy są kowalencyjnie połączone z białkiem, co powoduje obrót netto o 180 °. Najczęściej cytowanym (ale nie jedynym) modelem wyjaśniającym te fakty jest „model rotacji podjednostek” (ryc. 2). Niezależnie od modelu, dupleksy DNA znajdują się poza kompleksem białkowym, a do wymiany nici potrzebny jest duży ruch białka. W tym przypadku miejsca rekombinacji są nieco asymetryczne, co pozwala enzymowi odróżnić lewy i prawy koniec miejsca. Podczas generowania produktów lewe końce są zawsze łączone z prawymi końcami ich witryn partnerskich i odwrotnie. Powoduje to rekonstytucję różnych hybrydowych miejsc rekombinacji w produktach rekombinacji. Unika się łączenia lewego końca z lewym lub prawym z prawym ze względu na asymetryczną sekwencję „nakładania się” między naprzemiennymi punktami wymiany górnej i dolnej nici, co jest w jaskrawym przeciwieństwie do mechanizmu stosowanego przez rekombinazy tyrozynowe.
Na przykład reakcja katalizowana przez rekombinazę Cre może prowadzić do wycięcia segmentu DNA otoczonego dwoma miejscami (ryc. 3A), ale może również prowadzić do integracji lub odwrócenia orientacji flankowanego segmentu DNA (ryc. 3B ). To, jaki będzie wynik reakcji, jest podyktowane głównie względnymi lokalizacjami i orientacjami miejsc, które mają zostać zrekombinowane, ale także wrodzoną specyficznością danego systemu specyficznego dla miejsca. Wycięcia i inwersje występują, jeśli rekombinacja zachodzi między dwoma miejscami znajdującymi się na tej samej cząsteczce (rekombinacja wewnątrzcząsteczkowa) i jeśli miejsca są odpowiednio w tej samej (powtórzenie bezpośrednie) lub w przeciwnej orientacji (powtórzenie odwrócone). Z drugiej strony insercje mają miejsce, jeśli rekombinacja zachodzi w miejscach, które znajdują się na dwóch różnych cząsteczkach DNA (rekombinacja międzycząsteczkowa), pod warunkiem, że co najmniej jedna z tych cząsteczek jest kolista. Większość systemów specyficznych dla miejsca jest wysoce wyspecjalizowana, katalizuje tylko jeden z tych różnych typów reakcji i ewoluowała tak, aby ignorować miejsca, które są w „złej” orientacji.