Ścieżka wykrywania cytozolowego DNA cGAS – STING
Szlak cGAS-STING jest składnikiem wrodzonego układu odpornościowego , który działa w celu wykrycia obecności cytozolowego DNA iw odpowiedzi wyzwala ekspresję genów zapalnych, które mogą prowadzić do starzenia się lub aktywacji mechanizmów obronnych. DNA normalnie znajduje się w jądrze komórki. Lokalizacja DNA w cytosolu jest związana z powstawaniem nowotworów , infekcją wirusową i inwazją niektórych bakterii wewnątrzkomórkowych. Szlak cGAS – STING wykrywa cytozolowe DNA i indukuje odpowiedź immunologiczną.
Po związaniu DNA białkowa cykliczna syntaza GMP-AMP ( cGAS ) wyzwala reakcję GTP i ATP, tworząc cykliczny GMP-AMP (cGAMP). cGAMP wiąże się ze stymulatorem genów interferonu ( STING ), który wyzwala fosforylację IRF3 przez TBK1 . IRF3 może następnie przejść do jądra, aby wywołać transkrypcję genów zapalnych. Szlak ten odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w obronie immunologicznej przeciwko wirusom z dwuniciowym DNA .
Wrodzony układ odpornościowy polega na kodowanych przez linię płciową receptorach rozpoznawania wzorców (PRR) w celu rozpoznawania różnych wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP). Po rozpoznaniu PAMP, PRR generują kaskady sygnałowe prowadzące do transkrypcji genów związanych z odpowiedzią immunologiczną. Ponieważ wszystkie patogeny wykorzystują kwas nukleinowy do namnażania się, DNA i RNA mogą być rozpoznawane przez PRR w celu wywołania aktywacji immunologicznej. W normalnych komórkach DNA ogranicza się do jądra lub mitochondriów . Obecność DNA w cytozolu wskazuje na uszkodzenie komórki lub infekcję i prowadzi do aktywacji genów związanych z odpowiedzią immunologiczną. Jednym ze sposobów wykrywania cytozolowego DNA jest szlak cGAS/STING, w szczególności syntaza cyklicznego GMP-AMP (cGAS). Po rozpoznaniu DNA cGAS dimeryzuje i stymuluje tworzenie cyklicznego GMP-AMP (cGAMP). cGAMP wiąże się następnie bezpośrednio ze stymulatorem genów interferonu (STING), który wyzwala fosforylację/aktywację czynnika transkrypcyjnego IRF3 poprzez TBK1. IRF3 jest w stanie wejść do jądra, aby promować transkrypcję genów zapalnych, takich jak IFN-β .
Cykliczna syntaza GMP-AMP (cGAS)
Struktura
cGAS jest białkiem o długości 522 aminokwasów i członkiem rodziny nukleotydylotransferazy . N-końcowe reszty 1-212 są niezbędne do wiązania dsDNA. Region ten może zawierać dwie różne domeny wiążące DNA. C-końcowe reszty 213-522 zawierają część motywu nukleotydylotransferazy (NTazy) i domenę Mab21 i są wysoce konserwatywne w cGAS od danio pręgowanego do ludzi. Regiony te są niezbędne do utworzenia kieszeni katalitycznej dla substratów cGAS: GTP i ATP oraz do przeprowadzenia niezbędnej reakcji cyklizacji.
Funkcjonować
cGAS znajduje się na błonie plazmatycznej i jest odpowiedzialny za wykrywanie cytozolowego dwuniciowego DNA, normalnie występującego w jądrze komórkowym, w celu stymulacji produkcji IFN-β. cGAS znajduje się również w jądrze, gdzie ścisłe połączenie z chromatyną uniemożliwia jej aktywację przez własny DNA. Po bezpośrednim związaniu cytozolowego DNA cGAS tworzy dimery, które katalizują wytwarzanie 2'3'-cGAMP z ATP i GTP. cGAMP działa następnie jako drugi przekaźnik, wiążąc się ze STING, aby wywołać aktywację czynnika transkrypcyjnego IRF3. IRF3 prowadzi do transkrypcji IFN-β typu 1. cGAS nie jest w stanie wytworzyć 2'3'-cGAMP w obecności RNA.
Odkrycie
Przed odkryciem cGAS było wiadomo, że interferon beta jest wytwarzany w obecności dsDNA cytozolu i że komórki z niedoborem STING nie są w stanie wytwarzać interferonu w obecności dsDNA. Poprzez biochemiczne frakcjonowanie ekstraktów komórkowych i ilościową spektrometrię mas, Sun i in. zidentyfikowali cGAS jako wykrywające DNA białko zdolne do wyzwalania interferonu beta poprzez syntezę drugiego przekaźnika, 2'3'-cGAMP. Ta aktywność jest zależna od cytozolowego DNA.
Aktywność enzymatyczna
cGAS katalizuje tworzenie cGAMP w obecności dsDNA. cGAS bezpośrednio wiąże dsDNA poprzez dodatnio naładowane reszty aminokwasowe oddziałujące z ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym DNA. Mutacje w dodatnio naładowanych resztach całkowicie znoszą wiązanie DNA i późniejszą produkcję interferonu przez STING. Po związaniu dsDNA, cGAS dimeryzuje i ulega zmianom konformacyjnym, które otwierają katalityczną kieszeń wiążącą nukleotyd, umożliwiając wejście GTP i ATP . Tutaj są stabilizowane poprzez układanie zasad, wiązania wodorowe i dwuwartościowe kationy w celu katalizowania tworzenia wiązań fosfodiestrowych w celu wytworzenia cyklicznego dinukleotydu cGAMP.
Cykliczny GMP-AMP (cGAMP)
Struktura
Cykliczny GMP-AMP (cGAMP) jest cyklicznym dinukleotydem (CDN) i pierwszym znalezionym w metazoanach. Inne CDN (c-di-GMP i c-di-AMP) są powszechnie spotykane w bakteriach, archeonach i pierwotniakach. Jak sama nazwa wskazuje, cGAMP jest cykliczną cząsteczką złożoną z jednego monofosforanu adeniny (AMP) i jednego monofosforanu guaniny (GMP) połączonych dwoma wiązaniami fosfodiestrowymi. Jednak cGAMP różni się od innych CDN tym, że zawiera unikalne wiązania fosfodiestrowe między 2' OH GMP i 5' fosforanem AMP. Drugie wiązanie znajduje się między 3' OH AMP i 5' fosforanem GMP. Unikalne wiązanie fosfodiestrowe 2'-5' może być korzystne, ponieważ jest mniej podatne na degradację powodowaną przez 3'-5' fosfodiesterazy. Inną zaletą unikalnego wiązania 2'-5' może być to, że cGAMP jest w stanie wiązać wiele allelicznych wariantów STING występujących w populacji ludzkiej, podczas gdy inne CDN, złożone tylko z wiązań 3'-5', nie są.
Odkrycie
cGAMP został odkryty przez Jamesa Chena i współpracowników poprzez zbieranie ekstraktów cytoplazmatycznych z komórek transfekowanych różnymi typami DNA. Ekstrakty komórkowe badano pod kątem aktywacji STING poprzez wykrywanie aktywowanych dimerów IRF3. Stosując chromatografię z oczyszczaniem powinowactwa , substancję aktywującą STING oczyszczono i zastosowano spektrometrię mas do zidentyfikowania substancji jako cyklicznego-GMP-AMP (cGAMP).
Wykazano, że chemicznie zsyntetyzowany cGAMP wyzwala aktywację IRF3 i wytwarzanie IFN-β. Stwierdzono, że cGAMP jest znacznie silniejszy niż inne cykliczne dinukleotydy (c-di-GMP i c-di-AMP). Wykazano, że cGAMP definitywnie wiąże STING przy użyciu znakowanego radioaktywnie cGAMP usieciowanego do STING. Stwierdzono, że dodanie nieznakowanego cGAMP, c-di-GMP lub c-di-AMP konkuruje ze znakowanym radioaktywnie cGAMP, co sugeruje, że miejsca wiązania CDN nakładają się. Później wykazano, że cGAMP ma unikalne wiązanie fosfodiestrowe 2'-5', które różni się od konwencjonalnych CDN połączonych 3'-5' i że to wiązanie może wyjaśniać niektóre unikalne właściwości sygnalizacyjne cGAMP.
Stymulator genów interferonu (STING)
STING jest białkiem rezydującym w retikulum endoplazmatycznym i wykazano, że bezpośrednio wiąże się z różnymi cyklicznymi dinukleotydami.
Wyrażenie
STING ulega szerokiej ekspresji w wielu typach tkanek, zarówno pochodzenia immunologicznego, jak i nieimmunologicznego. STING został zidentyfikowany w mysich fibroblastach zarodkowych i jest wymagany do interferonu typu 1 zarówno w komórkach odpornościowych, jak i nieimmunologicznych.
Struktura
STING to białko o długości 378 aminokwasów. Jego region N-końcowy (reszty 1-154) zawiera cztery domeny transbłonowe. Jego domena C-końcowa zawiera domenę dimeryzacji, domenę interakcji cyklicznych dinukleotydów, a także domenę odpowiedzialną za interakcję i aktywację TBK1. Po związaniu 2'-3' cGAMP, STING przechodzi znaczącą zmianę konformacyjną (obrót do wewnątrz o około 20 angstremów), która otacza cGAMP.
Funkcjonować
Po związaniu 2'-3' cGAMP (i innych bakteryjnych CDN), STING aktywuje TBK1 w celu fosforylacji dalszych czynników transkrypcyjnych IRF3, co indukuje odpowiedź IFN typu 1, oraz STAT6, który indukuje chemokiny , takie jak CCL2 i CCL20 , niezależnie od IRF3. Uważa się również, że STING aktywuje czynnik transkrypcyjny NF-κB poprzez aktywność kinazy IκB (IKK), chociaż mechanizm aktywacji NF-κB poniżej STING pozostaje do ustalenia. Szlaki sygnałowe aktywowane przez STING indukują wrodzoną odpowiedź immunologiczną na komórki z ektopowym DNA w cytozolu. Utrata aktywności STING hamuje zdolność fibroblastów embrionalnych myszy do zwalczania infekcji niektórymi wirusami, a bardziej ogólnie jest wymagana do odpowiedzi IFN typu 1 na wprowadzony cytozolowy DNA.
Sugeruje się, że ogólna rola STING jako cząsteczki adaptera w cytozolowej odpowiedzi IFN typu 1 DNA w różnych typach komórek działa poprzez komórki dendrytyczne (DC). DC łączą wrodzony układ odpornościowy z nabytym układem odpornościowym poprzez fagocytozę i prezentację obcego antygenu przez MHC . Odpowiedź IFN typu 1 zainicjowana przez DC, być może poprzez rozpoznanie fagocytowanego DNA, ma ważny efekt kostymulujący. Doprowadziło to ostatnio do spekulacji, że 2'-3' cGAMP można zastosować jako bardziej skuteczny i bezpośredni adiuwant niż DNA do indukowania odpowiedzi immunologicznych.
Zmienność alleliczna
Naturalnie występujące odmiany ludzkiego STING (hSTING) stwierdzono w pozycji aminokwasowej 232 (R232 i H232). Warianty H232 zmniejszyły odpowiedzi IFN typu 1, a mutacja w tej pozycji do alaniny znosi odpowiedź na bakteryjne CDN. Stwierdzono również substytucje wzmacniające wiązanie liganda. Wykazano, że substytucje G230A zwiększają sygnalizację hSTING po wiązaniu c-di-GMP. Pozostałość ta znajduje się na pokrywie kieszeni wiążącej, prawdopodobnie zwiększając zdolność wiązania c-di-GMP.
Biologiczne znaczenie szlaku cGAS-STING
Rola w odpowiedzi wirusowej
Szlak cGAS-cGAMP-STING jest zdolny do generowania interferonu beta w odpowiedzi na cytozolowy DNA. Wykazano, że wirusy DNA, takie jak HSV-1, są w stanie wywołać produkcję cGAMP, a następnie aktywację interferonu beta poprzez STING. Wirusy RNA, takie jak VSV lub wirus Sendai , nie są w stanie wywołać interferonu poprzez cGAS-STING. Myszy z defektem cGAS lub STING nie są w stanie wytwarzać interferonu w odpowiedzi na infekcję HSV-1, która ostatecznie prowadzi do śmierci, podczas gdy myszy z prawidłową funkcją cGAS i STING są w stanie wyzdrowieć.
Wykazano również, że retrowirusy, takie jak HIV-1, aktywują IFN poprzez szlak cGAS/STING. W badaniach tych inhibitory retrowirusowej odwrotnej transkrypcji znosiły wytwarzanie IFN, co sugeruje, że to wirusowe cDNA aktywuje cGAS.
Rola w nadzorze nowotworu
Szlak cGAS/STING odgrywa również rolę w nadzorze nowotworu. W odpowiedzi na stres komórkowy, taki jak uszkodzenie DNA, komórki będą zwiększać poziom ligandów NKG2D , aby mogły zostać rozpoznane i zniszczone przez komórki NK i T. W wielu komórkach nowotworowych odpowiedź na uszkodzenie DNA jest konstytutywnie aktywna, co prowadzi do akumulacji cytoplazmatycznego DNA. To aktywuje szlak cGAS/STING prowadzący do aktywacji IRF3. W komórkach chłoniaka wykazano, że ligand NKG2D, Rae1, był regulowany w górę w sposób zależny od STING/IRF3. Transfekcja DNA do tych komórek również wywołała ekspresję Rae1 zależną od STING. W tym modelu czynnik transkrypcyjny IRF3, poprzez cGAS / STING, zwiększa regulację w górę ligandów indukowanych stresem, takich jak Rae1, w komórkach nowotworowych, aby pomóc w usuwaniu guza za pośrednictwem NK. Ponadto wykazano, że aktywacja szlaku STING w makrofagach szpiku kostnego hamuje wzrost komórek ostrej białaczki szpikowej w modelach myszy.
Rola w chorobach autoimmunologicznych
Cytoplazmatyczne DNA, z powodu infekcji wirusowej, może prowadzić do aktywacji interferonu beta, aby pomóc usunąć infekcję. Jednak przewlekła aktywacja STING, spowodowana DNA gospodarza w cytozolu, może również aktywować szlak cGAS/STING, prowadząc do zaburzeń autoimmunologicznych. Przykładem tego jest zespół Aicardi-Goutières (AGS). Mutacje w egzonukleazie naprawczej 3', TREX1, powodują gromadzenie się endogennych retroelementów w cytozolu, co może prowadzić do aktywacji cGAS/STING, co prowadzi do produkcji IFN. Nadmierna produkcja IFN prowadzi do nadaktywności układu odpornościowego, co skutkuje AGS i innymi zaburzeniami odporności. U myszy stwierdzono, że objawy autoimmunologiczne związane z niedoborem TREX1 zostały złagodzone przez nokaut cGAS, STING lub IRF3, co sugeruje znaczenie nieprawidłowego wykrywania DNA w zaburzeniach autoimmunologicznych.
Rola w starzeniu komórkowym
Wykazano, że wyczerpanie cGAS i STING w fibroblastach embrionalnych myszy i pierwotnych fibroblastach ludzkich zapobiega starzeniu się i powstawaniu SASP ( fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem ).
Rola terapeutyczna
Potencjalny adiuwant szczepionkowy
Wykazano, że DNA jest silnym adiuwantem wzmacniającym odpowiedź immunologiczną na antygeny kodowane przez szczepionki. cGAMP, poprzez aktywację STING przez IRF3, stymuluje transkrypcję interferonu. To sprawia, że cGAMP jest potencjalnym adiuwantem szczepionkowym zdolnym do nasilenia odpowiedzi zapalnych. Badania wykazały, że szczepionki kodowane antygenem kurczaka, albuminą jaja kurzego (OVA), w połączeniu z cGAMP, były w stanie aktywować komórki T i B swoiste dla antygenu w sposób zależny od STING in vivo. Wykazano, że po stymulacji peptydem OVA komórki T myszy szczepionych OVA + cGAMP miały podwyższone IFN-g i IL-2 w porównaniu ze zwierzętami otrzymującymi tylko OVA. Ponadto zwiększona stabilność cGAMP, dzięki unikalnemu wiązaniu fosfodiestrowemu 2'-5', może sprawić, że będzie on preferowanym adiuwantem do DNA do zastosowań in vivo.