Ślad białka

„Ślad białkowy” to termin używany w odniesieniu do metody analizy biochemicznej, która bada strukturę , składanie i interakcje białek w większym zespole makrocząsteczkowym . Pierwotnie sformułowano go w odniesieniu do zastosowania ograniczonej proteolizy do badania miejsc kontaktu w obrębie kompleksu przeciwciało monoklonalne - antygen białkowy, a rok później do zbadania ochrony przed rozszczepieniem rodników hydroksylowych zapewnianej przez białko związane z DNA w kompleksie DNA-białko. W przypadku śladu DNA przewiduje się, że białko tworzy odcisk (lub ślad) . ) w określonym punkcie interakcji. Ta ostatnia metoda została zaadaptowana poprzez bezpośrednią obróbkę białek i ich kompleksów hydroksylowymi i może być ogólnie oznaczona jako RP-MS (od Radical Probe - spektrometria mas), podobnie jak oznaczenie stosowane w spektrometrii mas z wymianą wodoru i deuteru (oznaczone jako HD-MS lub HX-MS).

Ślad białek rodnikowych hydroksylowych

Rozdzielczy w czasie ślad białkowy rodników hydroksylowych (HRPF) wykorzystujący analizę spektrometrii masowej powstał i rozwinął się pod koniec lat 90. XX wieku w badaniach radiolizy synchrotronowej . W tym samym roku autorzy ci (Maleknia i in.) donieśli o zastosowaniu źródła wyładowań elektrycznych do wywoływania utleniania białek w milisekundowych skalach czasowych, gdy białka przechodzą z roztworu natryskiwanego metodą elektrorozpylania do spektrometru mas. Wiele lat później, w 2005 roku, badacze Hambly i Gross wprowadzili metodę utleniania białek w mikrosekundowej skali czasu przy użyciu fotolizy błysku lasera nadtlenku wodoru w celu wytworzenia rodników hydroksylowych. Metoda ta, czyli szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP), twierdzona, że pozostawia ślad białek szybciej niż zmieniają ich fałd , chociaż ten przedział czasowy został zakwestionowany, biorąc pod uwagę nadtlenek wodoru, nieobecny w oryginalnych badaniach, oraz rodniki wtórne, które reagują samotnie in situ przez dziesiątki milisekundy. Od tego czasu podejścia te zastosowano do określenia struktur białek, fałdowania białek, dynamiki białek i interakcji białko-białko.

W przeciwieństwie do kwasów nukleinowych, w tych ramach czasowych białka raczej utleniają się niż rozszczepiają. Analiza produktów metodą spektrometrii mas ujawnia, że białka są utleniane w ograniczony sposób (około 10–30% całkowitego białka) w wielu łańcuchach bocznych aminokwasów w białkach. Szybkość lub poziom utleniania reaktywnych łańcuchów bocznych aminokwasów (Met, Cys, Trp, Tyr, Phe, His, Pro i Leu) stanowi miarę ich dostępności dla rozpuszczalnika w masie. Mechanizmy utleniania łańcuchów bocznych badano przeprowadzając reakcje radiolizy w wodzie znakowanej ^18O .

Wytwarzanie rodników OH

Krytyczną cechą tych eksperymentów jest potrzeba wystawiania białek na działanie rodników hydroksylowych w ograniczonych ramach czasowych, rzędu 1–50 ms, wywołując 10–30% utlenianie całkowitego białka. Kolejnym wymaganiem jest wytwarzanie rodników hydroksylowych z rozpuszczalnika w masie (tj. wody) (równania 1 i 2), a nie nadtlenku wodoru, który może pozostać w celu utlenienia białek nawet bez innych bodźców.

H ₂ O → H ₂ O ^+• + mi ⁻ + H ₂ O ^*

H ₂ O ^+• + H ₂ O → H ₃ O ⁺ + OH ^•

Rodniki hydroksylowe można wytwarzać w roztworze w wyniku wyładowania elektrycznego w konwencjonalnym źródle jonizacji przez elektrorozpylanie pod ciśnieniem atmosferycznym (ESI). Kiedy między igłą elektrorozpylania a otworem próbkującym w analizatorze masy utrzymuje się duża różnica napięcia (~8 keV), na końcówce igły do elektrorozpylania mogą powstawać rodniki w roztworze. Metoda ta była pierwszą zastosowaną do zastosowania śladu białkowego w badaniu kompleksu białkowego.

metoda

Ekspozycja białek na „białą” wiązkę promieni rentgenowskich światła synchrotronowego lub wyładowanie elektryczne przez dziesiątki milisekund zapewnia wystarczającą modyfikację oksydacyjną powierzchniowych łańcuchów bocznych aminokwasów bez uszkodzenia struktury białka. Produkty te można łatwo wykryć i określić ilościowo za pomocą spektrometrii mas. Dostosowując czas radiolizy lub to, które jony białkowe spędzają w źródle wyładowania, możliwe jest podejście zależne od czasu, które jest cenne w badaniu dynamiki białek.

Analiza

Napisano także program komputerowy (PROXIMO), który ma pomóc w modelowaniu kompleksów białkowych przy użyciu danych z metody RP-MS/Protein Footing. W badaniach RP-MS/śladów białkowych kompleksów białkowych można również zastosować podejścia obliczeniowe, aby pomóc w modelowaniu.

Aplikacje

Zastosowanie spektrometrii mas ruchliwości jonów niezbicie wykazało, że warunki stosowane w eksperymentach ze śladem RP-MS/Protein nie zmieniają struktury białek.

W innych badaniach rozszerzono tę metodę o badanie uszkodzeń białek o wczesnym początku, biorąc pod uwagę radykalne podstawy metody i znaczenie rodników tlenowych w patogenezie wielu chorób, w tym zaburzeń neurologicznych, a nawet ślepoty.

Zobacz też