Wymiana wodór-deuter
Wymiana wodór-deuter (zwana także wymianą H-D lub H/D) to reakcja chemiczna , w której kowalencyjnie związany atom wodoru jest zastępowany deuterem atom lub odwrotnie. Najprościej można go zastosować do wymiennych protonów i deuteronów, gdzie taka przemiana zachodzi w obecności odpowiedniego źródła deuteru, bez żadnego katalizatora. Zastosowanie katalizatorów kwasowych, zasadowych lub metalicznych, w połączeniu z warunkami podwyższonej temperatury i ciśnienia, może ułatwić wymianę niewymiennych atomów wodoru, o ile podłoże jest odporne na warunki i stosowane odczynniki. Często prowadzi to do perdeuteracji: wymiany wodoru na deuter wszystkich niewymiennych atomów wodoru w cząsteczce.
Przykładem wymiennych protonów, które są powszechnie badane w ten sposób, są protony amidów w szkielecie białka . Metoda dostarcza informacji o rozpuszczalnika dla różnych części cząsteczki, a co za tym idzie o trzeciorzędowej strukturze białka. Teoretyczne ramy zrozumienia wymiany wodoru w białkach zostały po raz pierwszy opisane przez Kaja Ulrika Linderstrøm-Langa, który jako pierwszy zastosował wymianę H/D do badania białek.
Reakcja wymiany
W roztworze protonowym wymienialne protony, takie jak te w grupie hydroksylowej lub aminowej, wymieniają protony z rozpuszczalnikiem . Jeśli D 2 O jest rozpuszczalnikiem, w tych pozycjach zostaną włączone deuterony. Reakcję wymiany można śledzić przy użyciu różnych metod (patrz Wykrywanie). Ponieważ ta wymiana jest reakcją równowagową, molowa ilość deuteru powinna być wysoka w porównaniu z wymiennymi protonami substratu. Na przykład deuter dodaje się do białka w H2O przez rozcieńczenie roztworu H2O D2 O (np. dziesięciokrotnie). Zwykle wymianę przeprowadza się przy fizjologicznym pH (7,0–8,0), gdzie białka znajdują się w najbardziej natywnym zespole stanów konformacyjnych.
Reakcję wymiany H/D można również katalizować katalizatorami kwasowymi, zasadowymi lub metalowymi, takimi jak platyna. W przypadku atomów wodoru w amidzie szkieletu białek minimalna szybkość wymiany występuje średnio przy około pH 2,6. wygasić tempo wymiany wodorów amidów szkieletowych . Wartość pH, przy której reakcja zostaje zatrzymana, zależy od metody analizy. W celu wykrycia metodą NMR pH można podnieść do około 4,0–4,5. W celu wykrycia metodą spektrometrii mas pH obniża się do minimum krzywej wymiany, pH 2,6. W najbardziej podstawowym eksperymencie reakcja zachodzi przez określony czas, zanim zostanie zatrzymana.
Wzór deuteracji cząsteczki, która przeszła wymianę H/D, może być zachowany w środowiskach aprotonowych. Jednak niektóre metody analizy deuteracji cząsteczek, takich jak białka, są przeprowadzane w roztworze wodnym, co oznacza, że wymiana będzie kontynuowana z małą szybkością nawet po wygaśnięciu reakcji. Niepożądana wymiana deuter-wodór jest określana jako wymiana wsteczna i opracowano różne metody, aby to skorygować.
Wykrycie
Wymiana H – D została pierwotnie zmierzona przez ojca wymiany wodoru, Kaja Ulrika Linderstrøm-Langa , przy użyciu rurek z gradientem gęstości. W czasach nowożytnych wymianę H-D monitorowano przede wszystkim metodami: spektroskopii NMR , spektrometrii mas i krystalografii neutronów . Każda z tych metod ma swoje zalety i wady.
Spektroskopia NMR
Jądra wodoru i deuteru znacznie różnią się właściwościami magnetycznymi. W ten sposób możliwe jest ich rozróżnienie za pomocą spektroskopii NMR . Deuterony nie będą obserwowane w 1H NMR i odwrotnie, protony nie będą obserwowane w widmie 2H NMR. Tam, gdzie obserwuje się małe sygnały w 1H NMR silnie deuterowanej próbki, określa się je jako sygnały resztkowe. Można ich użyć do obliczenia poziomu deuteracji w cząsteczce. Analogicznych sygnałów nie obserwuje się w 2 Widma H NMR ze względu na niską czułość tej techniki w porównaniu z analizą 1H . Deuterony zazwyczaj wykazują bardzo podobne przesunięcia chemiczne do swoich analogicznych protonów. analiza za pomocą 13 C NMR : różne wartości spinów wodoru ( 1/2 ) i deuteru (1) powodują różne krotności rozszczepienia . Spektroskopię NMR można wykorzystać do określenia specyficznej dla miejsca deuteracji cząsteczek.
Inna metoda wykorzystuje widma HSQC. Zazwyczaj HSQC są rejestrowane w szeregu punktów czasowych, podczas gdy wodór wymienia się z deuterem. Ponieważ eksperyment HSQC jest specyficzny dla wodoru, sygnał będzie zanikał wykładniczo w miarę wymiany wodoru. Możliwe jest wtedy dopasowanie funkcji wykładniczej do danych i uzyskanie stałej wymiany. Ta metoda daje pozostałość -specyficzne informacje dla wszystkich reszt w białku jednocześnie Główną wadą jest to, że wymaga wcześniejszego przypisania widma dla danego białka. Może to być bardzo pracochłonne i zwykle ogranicza metodę do białek mniejszych niż 25 kDa . Ponieważ rejestracja widma HSQC trwa od minut do godzin, amidy, które szybko się wymieniają, muszą być mierzone przy użyciu innych sekwencji impulsów.
Spekrtometria masy
Spektrometria mas z wymianą wodoru i deuteru może określić całkowitą zawartość deuteru w cząsteczkach, które przeszły wymianę H/D. Ze względu na wymagane przygotowanie próbki zwykle uważa się, że zapewnia to dokładny pomiar tylko niewymiennych atomów wodoru. Może również obejmować wymianę H/D w fazie gazowej lub wymianę fazy roztworu przed jonizacją. Ma kilka zalet w spektroskopii NMR w odniesieniu do analizy reakcji wymiany H – D: potrzeba znacznie mniej materiału, stężenie próbki może być bardzo niskie (nawet 0,1 uM), granica rozmiaru jest znacznie większa, a dane mogą zwykle są gromadzone i interpretowane znacznie szybciej.
Jądro deuteru jest dwa razy cięższe niż jądro wodoru, ponieważ zawiera neutron i proton. Zatem cząsteczka zawierająca trochę deuteru będzie cięższa niż cząsteczka zawierająca cały wodór. Ponieważ białko jest coraz bardziej deuterowane, masa cząsteczkowa odpowiednio wzrasta. Wykrywanie zmiany masy białka po deuteracji było możliwe dzięki nowoczesnej spektrometrii masowej białek, po raz pierwszy opisanej w 1991 roku przez Kattę i Chaita.
Określenie specyficznej dla miejsca deuteracji za pomocą spektrometrii mas jest bardziej skomplikowane niż przy użyciu spektroskopii NMR. Na przykład lokalizację i względną ilość wymiany deuteru wzdłuż szkieletu peptydu można z grubsza określić przez poddanie białka proteolizie po wygaszeniu reakcji wymiany. Poszczególne peptydy są następnie analizowane pod kątem ogólnej deuteracji każdego fragmentu peptydu. Przy użyciu tej techniki rozdzielczość wymiany deuteru jest określana na podstawie wielkości peptydów wytwarzanych podczas trawienia. Pepsyna , kwaśna proteaza , jest powszechnie stosowany do proteolizy, ponieważ podczas reakcji proteolitycznej musi być utrzymane pH wygaszające. Aby zminimalizować wymianę wsteczną, należy jak najszybciej przeprowadzić proteolizę i późniejszą analizę spektrometrii mas. Rozdział hydrolizatu metodą HPLC jest często przeprowadzany w niskiej temperaturze tuż przed spektrometrią mas przez elektrorozpylanie, aby zminimalizować wymianę wsteczną. Niedawno zastosowano UPLC ze względu na jego doskonałe możliwości separacji.
W 1999 roku zaproponowano, że możliwe byłoby osiągnięcie rozdzielczości pojedynczych reszt za pomocą fragmentacji deuterowanych peptydów w wyniku dysocjacji wywołanej kolizją (CID) w połączeniu z tandemową spektrometrią mas . Wkrótce odkryto, że CID powoduje „mieszanie” pozycji deuteru w peptydach. Jednak fragmentacja wytwarzana przez rozpad źródła MALDI (ISD), dysocjację wychwytu elektronów (ECD) i dysocjację przeniesienia elektronu (ETD) przebiegają z niewielkim lub żadnym szyfrowaniem w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. Zaszyfrowanie znakowania izotopowego jest spowodowane ogrzewaniem kolizyjnym przed dysocjacją jonu i chociaż CID powoduje mieszanie, ogrzewanie kolizyjne może również wystąpić podczas jonizacji i transportu jonów. Jednak poprzez staranną optymalizację parametrów przyrządu, które powodują nagrzewanie jonów, mieszanie wodoru można zminimalizować do stopnia, który zachowuje znakowanie izotopowe fazy roztworu do czasu przeprowadzenia fragmentacji przy użyciu techniki, w której nie występuje mieszanie. Niedawno badano również fotodysocjację w ultrafiolecie (UVPD) jako możliwą technikę fragmentacji do lokalizacji deuteru w peptydach i białkach. Pod tym względem wnioski były mieszane, podczas gdy możliwe jest uzyskanie fragmentów UVPD, które nie zostały poddane szyfrowaniu w pewnych warunkach, inni wykazali, że szyfrowanie może wystąpić zarówno dla peptydów, jak i białek podczas samego etapu fragmentacji UVPD. Teoria utrwalająca te pozorne sprzeczności dotyczy podwójnej ścieżki fragmentacji, która może powstać w wyniku naświetlania peptydów i białek promieniowaniem UV, tj. dysocjacji bezpośredniej i statystycznej. Oznacza to, że jeśli warunki eksperymentalne sprzyjają bezpośredniej dysocjacji, a jon prekursorowy jest utrzymywany przy niskich energiach wewnętrznych przed i podczas fragmentacji, poziom deuteru w powstałych fragmentach będzie odpowiadał prekursorowi bez kodowania. Jednak warunki eksperymentalne mogą sprzyjać dysocjacji statystycznej podczas naświetlania UV, zwłaszcza przy długich czasach napromieniania i niskim ciśnieniu gazu, co prowadzi do wewnętrznej konwersji energii wzbudzenia elektronowego wnoszonej przez fotony UV. Rezultatem jest wzbudzenie wibracyjne napromieniowanej cząsteczki, która z kolei ulega zaszyfrowaniu.
Krystalografia neutronowa
Wymianę wodór-deuter w szybko wymieniających się formach (np. grupach hydroksylowych) można mierzyć ilościowo z rozdzielczością atomową za pomocą krystalografii neutronowej oraz w czasie rzeczywistym, jeśli wymiana jest prowadzona podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.
Wiązki neutronów o dużym natężeniu są generalnie generowane przez spallację w akceleratorach cząstek liniowych, takich jak Spallation Neutron Source . Neutrony uginają kryształy podobnie jak promienie rentgenowskie i mogą być wykorzystywane do określania struktury. Atomy wodoru, zawierające od jednego do zera elektronów w warunkach biologicznych, słabo uginają promieniowanie rentgenowskie i są skutecznie niewidoczne w normalnych warunkach eksperymentalnych. Neutrony rozpraszają się na jądrach atomowych i dlatego są zdolne do wykrywania atomów wodoru i deuteru.
Atomy wodoru są rutynowo zastępowane deuterem, który wprowadza silny i dodatni współczynnik rozpraszania. Często wystarczy zastąpić tylko rozpuszczalnik i nietrwałe atomy wodoru w krysztale białka przez dyfuzję pary. W takiej strukturze obłożenie wymiennego atomu deuteru w krysztale będzie się zmniejszać od 0 do 100%, bezpośrednio określając ilość wymiany.
Aplikacje
Rozpraszanie neutronów
Perdeuteracja jednego składnika układu wieloskładnikowego może zapewnić kontrast w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów , w których kontrast uzyskany przy użyciu rozpuszczalników deuterowanych jest niewystarczający. [ potrzebne źródło ]
Struktura białka
Nie jest możliwe określenie struktury białka z wymianą H/D inną niż krystalografia neutronowa ani określenie drugorzędowych elementów strukturalnych. Przyczyny tego są związane ze sposobem, w jaki struktura białka spowalnia wymianę. Kursy wymiany są funkcją dwóch parametrów: dostępności rozpuszczalnika i wiązań wodorowych. Zatem amid, który jest częścią wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego będzie wymieniał się powoli, jeśli w ogóle, podczas gdy amid na powierzchni białka związanego wodorem z wodą będzie wymieniał się szybko. Amidy ukryte w rozpuszczalniku, ale nie związane wiązaniami wodorowymi, mogą również mieć bardzo niskie szybkości wymiany. Ponieważ zarówno dostępność rozpuszczalnika, jak i wiązanie wodorowe wpływają na szybkość wymiany, trudno jest przypisać dany kurs wymiany elementowi strukturalnemu bez danych strukturalnych krystalografii lub NMR.
Wymianę H – D zastosowano do scharakteryzowania szlaku fałdowania białek poprzez ponowne fałdowanie białka w warunkach wymiany. W eksperymencie z wymianą w przód (H do D) po różnych okresach czasu ponownego fałdowania dodaje się impuls deuteru. Części struktury, które tworzą się szybko, będą chronione, a zatem nie będą wymieniane, podczas gdy obszary, które składają się późno na ścieżce, będą narażone na wymianę przez dłuższe okresy czasu. Zatem wymiana H/D może być wykorzystana do określenia sekwencji różnych zdarzeń składania. Czynnikami determinującymi rozdzielczość czasową tego podejścia są wydajność mieszania i szybkość hartowania po znakowaniu.
Wymiana H – D została wykorzystana do scharakteryzowania struktur białek i interakcji białko-białko. Reakcję wymiany należy przeprowadzić z wyizolowanymi białkami i kompleksem. Wymienione regiony są następnie porównywane. Jeśli region jest zakopany przez wiązanie, amidy w tym regionie mogą być chronione w kompleksie i wymieniać się powoli. Należy jednak pamiętać, że wymiany H – D nie można wykorzystać do zlokalizowania interfejsów wiążących dla wszystkich interakcji białko-białko. Niektóre interakcje białko-białko są napędzane przez siły elektrostatyczne łańcuchów bocznych i jest mało prawdopodobne, aby zmieniły szybkość wymiany wodorów amidowych szkieletu, szczególnie jeśli wodory amidowe znajdują się w stabilnych elementach strukturalnych, takich jak helisy alfa .
Wreszcie, wymianę H-D można wykorzystać do monitorowania zmian konformacyjnych białek w odniesieniu do ich funkcji. Jeśli konformacja zostanie zmieniona w wyniku modyfikacji potranslacyjnej , aktywacji enzymu, wiązania leku lub innych zdarzeń funkcjonalnych, prawdopodobnie nastąpi zmiana wymiany H/D, którą można wykryć.
Serwer internetowy HDXsite
HDXsite to internetowy serwer sieciowy, który zawiera kilka aplikacji, takich jak modeler HDX zwiększający rozdzielczość eksperymentalnych danych HDX i modelujący współczynniki ochrony dla poszczególnych reszt.
Dalsza lektura
- David Weis, wyd. (2016). Spektrometria mas białek z wymianą wodoru: podstawy, metody i zastosowania . Nowy Jork: Wiley. ISBN 9781118616499 .
- Masson GR, Burke JE, Ahn NG, Anand GS, Borchers C, Brier S i in. (lipiec 2019). „Zalecenia dotyczące wykonywania, interpretowania i raportowania eksperymentów spektrometrii mas z wymianą wodoru i deuteru (HDX-MS)” . Metody natury . 16 (7): 595–602. doi : 10.1038/s41592-019-0459-y . PMC 6614034 . PMID 31249422 .