Bakteryjny system jednohybrydowy

Rysunek 1: Przegląd bakteryjnego systemu jednohybrydowego . Biblioteka losowych nukleotydów reprezentujących potencjalne miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego (10–20 par zasad), „ofiara”, jest klonowana powyżej HIS3 i URA3, odpowiednio pozytywnych i negatywnych markerów selekcyjnych. Jeśli czynnik transkrypcyjny zwiąże się z randomizowanym regionem, zrekrutuje polimerazę RNA poprzez bezpośrednią fuzję z podjednostką α lub ω, a tym samym aktywuje transkrypcję dalszych genów reporterowych. Stosowany szczep gospodarza E. coli musi być pozbawiony bakteryjnych homologów tych biosyntetycznych genów (HIS3 i URA3).

System jednej hybrydy bakteryjnej (B1H) jest metodą identyfikacji specyficznego dla sekwencji miejsca docelowego domeny wiążącej DNA . W tym systemie dany czynnik transkrypcyjny (TF) jest wyrażany jako fuzja z podjednostką polimerazy RNA . Równolegle bibliotekę randomizowanych oligonukleotydów reprezentujących potencjalne docelowe sekwencje TF klonuje się do oddzielnego wektora zawierającego geny selekcyjne HIS3 i URA3 . Jeśli domena wiążąca DNA (przynęta) wiąże potencjalne docelowe miejsce DNA (ofiarę) in vivo , rekrutuje polimerazę RNA do promotora i aktywuje transkrypcję genów reporterowych w tym klonie. Dwa geny reporterowe, HIS3 i URA3, umożliwiają odpowiednio pozytywną i negatywną selekcję. Pod koniec procesu pozytywne klony są sekwencjonowane i badane za pomocą narzędzi do znajdowania motywów w celu wyodrębnienia preferowanej docelowej sekwencji DNA.

Wstęp

We wszystkich żywych organizmach regulacja ekspresji genów jest kontrolowana przez interakcje między białkami regulatorowymi wiążącymi DNA (czynnikami transkrypcyjnymi) a elementami regulatorowymi cis , sekwencjami DNA w genach lub wokół nich, które działają jako miejsca docelowe dla białek wiążących DNA. Wiążąc się z sekwencjami regulatorowymi cis i między sobą, czynniki transkrypcyjne dostrajają poziomy transkrypcji poprzez stabilizację/destabilizację wiązania polimerazy RNA z promotorem genu. Jednak pomimo ich znaczenia i wszechobecności niewiele wiadomo o tym, gdzie dokładnie wiąże się każde z tych białek regulatorowych. Literatura sugeruje, że prawie 8% ludzkich genów koduje czynniki transkrypcyjne, a funkcje i specyfika ich interakcji pozostają w dużej mierze niezbadane. Jesteśmy na krawędzi konwergencji wysokowydajnych technologii i teorii genomicznej, która pozwoli naukowcom rozpocząć mapowanie tych interakcji w skali całego genomu. Dopiero niedawno podjęto próbę pełnego badania specyficzności wiązania DNA dla dużej rodziny domen wiążących DNA. B1H to tylko jedna z wielu pojawiających się technik przydatnych do badania interakcji białko-DNA.

Przegląd metod

Rycina 2: Bakteryjny system jednej hybrydy wymaga dwóch dostosowanych plazmidów: (a) wektora „przynęty” (pB1H1 lub pB1H2), który wyraża domenę wiążącą DNA jako konstrukt fuzyjny z podjednostką (α lub ω) polimerazy RNA, oraz (b) plazmid reporterowy (pH3U3) zawierający markery selekcyjne i bibliotekę miejsc wiązania lub „ofiara”, która potencjalnie będzie oddziaływać z „przynętą”.

Wymagana jest transformacja gospodarza bakteryjnego dwoma różnymi plazmidami . Jeden jest przeznaczony do ekspresji białka wiążącego DNA będącego przedmiotem zainteresowania jako konstrukt fuzyjny z podjednostką polimerazy RNA (przynęta). Drugi plazmid zawiera region o losowej sekwencji reprezentujący potencjalne miejsca wiązania (ofiara), które, jeśli są związane z chimerowym produktem fuzyjnym, napędzają ekspresję dalszych genów reporterowych. Ten region reporterowy ułatwia zarówno pozytywną, jak i negatywną selekcję odpowiednio przez HIS3 i URA3, co razem pozwala na izolację ofiary zawierającej prawdziwą docelową sekwencję DNA. HIS3 i URA3 kodują białka niezbędne do biosyntezy histydyny i uracylu.

Użycie negatywnego markera selekcyjnego ma kluczowe znaczenie dla znacznego zmniejszenia częstości występowania wyników fałszywie dodatnich. Samoaktywująca się zdobycz, w której randomizowany region ułatwia ekspresję reportera przy braku wiązania TF, jest usuwana przez transformację biblioteki wektorów reporterowych do bakterii bez przynęty i testowanie wzrostu na płytkach zawierających kwas 5-fluoroorotowy (5- FOA). Produkt białkowy URA3 przekształca 5-FOA w związek toksyczny, umożliwiając w ten sposób przeżycie tylko tym koloniom, które zawierają wektory reporterowe, które nie są samoaktywujące. Selekcja negatywna zwykle poprzedza selekcję pozytywną, dzięki czemu mniejsza, oczyszczona biblioteka ofiar może zostać poddana bardziej rygorystycznemu procesowi selekcji pozytywnej. Po transformacji oczyszczonej biblioteki zdobyczy plazmidem przynęty, pozytywną selekcję uzyskuje się przez hodowanie gospodarza E. coli na minimalnym podłożu pozbawionym histydyny (pożywka selekcyjna NM), która jest zwykle uzupełniona różnymi stężeniami 3-amino-triazolu (3-AT ), kompetycyjny inhibitor HIS3. HIS3 koduje białko wymagane do biosyntezy histydyny, a zatem tylko te komórki zawierające kombinacje przynęta-ofiara, które aktywują geny reporterowe, będą mogły rosnąć. Manipulowanie stężeniami 3-AT pozwala na scharakteryzowanie surowości wiązania. W ten sposób naukowcy mogą ocenić, jak silnie przynęta wiąże swoją ofiarę (skorelowane z poziomem ekspresji HIS3), a tym samym określić, które miejsca wiązania nukleotydów mają silne lub słabe preferencje dla danej zasady. Innymi słowy, jeśli komórki mogą rosnąć pomimo wysokiego stężenia 3-AT, wiązanie przynęty z ofiarą musi być wystarczająco ostre, aby napędzać ekspresję genu reporterowego (HIS3) na poziomie wystarczającym do przezwyciężenia wynikającego z tego hamowania konkurencyjnego. Na koniec pozytywne klony są sekwencjonowane i badane za pomocą istniejących wcześniej narzędzi do wyszukiwania motywów (np. MEME, BioProspector).

Historia metody

Bakteryjny system jednohybrydowy przeszedł liczne modyfikacje od czasu jego powstania w 2005 roku. Ostatecznie powstał jako odmiana bakteryjnego systemu dwuhybrydowego, wymyślonego w 2000 roku, który sam był inspirowany drożdżowymi systemami jedno- i dwuhybrydowymi. Podczas gdy wersje dwuhybrydowe mogą oceniać zarówno interakcje białko-białko , jak i interakcje białko-DNA, system jednohybrydowy specjalizuje się w tym drugim. System B1H Menga i wsp. różni się od wersji dwuhybrydowej pod dwoma kluczowymi względami. Wykorzystuje losową bibliotekę zdobyczy składającą się z wielu (<2x108 ⁾ unikalnych potencjalnych sekwencji docelowych, a także dodaje etap selekcji negatywnej w celu oczyszczenia tej biblioteki z samoaktywujących się klonów. Chociaż pomysły te zostały zapożyczone z oryginalnego systemu jednohybrydowego drożdży, przed 2005 r. nie zastosowano ich wobec żywiciela bakteryjnego. Wraz ze wzrostem popularności techniki naukowcy zmienili swoje protokoły, aby ulepszyć system B1H. Projektowanie konstruktu fuzyjnego (przynęty) dla podjednostki omega, a nie alfa, polimerazy RNA było ostatnio faworyzowane w celu poprawy stereochemii i zakresu dynamicznego chimery. Dodano również domenę palca cynkowego na konstrukcie fuzyjnym i odpowiadające jej miejsce docelowe DNA, sąsiadujące z losową sekwencją ofiary, aby zwiększyć powinowactwo i specyficzność interakcji białko- DNA . To zwiększone ogólne powinowactwo wiązania pozwala na scharakteryzowanie nawet tych białek domeny wiążącej DNA, które słabo oddziałują z sekwencją docelową.

Ryc. 3: Przegląd procedury selekcji negatywnej i pozytywnej B1H. Segment DNA oznaczony „RR” odnosi się do losowego regionu na wektorach zdobyczy. Sekwencje samoaktywujące są usuwane z oryginalnej biblioteki miejsc wiążących poprzez próbę wyhodowania E.coli transformowanej ofiarą na podłożu zawierającym 5-FOA, związek, który jest rozszczepiany na toksynę przez URA3. Otrzymaną oczyszczoną bibliotekę zdobyczy transformuje się następnie plazmidem przynęty i hoduje na podłożu minimalnym pozbawionym histydyny w celu pozytywnej selekcji pod kątem aktywnie eksprymowanych wektorów reporterowych. Pożywkę tę uzupełnia się różnymi stężeniami 3-AT, kompetycyjnego inhibitora HIS3, w celu wyjaśnienia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego z każdą konkretną sekwencją docelową. Randomizowane regiony z kolonii, które przeżyły, są następnie izolowane i sekwencjonowane przed analizą w celu znalezienia motywu (np. MEME, BioProspector). Na koniec generowane są optymalne i tolerowane zasady w kluczowych pozycjach miejsc wiązania

.

Zalety

System B1H ma znaczną przewagę nad innymi metodami badania interakcji białko-DNA. Oparty na mikromacierzy odczyt immunoprecypitacji chromatyny ( chip ChIP ) do wysokowydajnego określania miejsca wiązania opiera się na swoistych przeciwciałach, które nie zawsze są dostępne. Metody oparte na mikromacierzach wiążących białka wymagają również dodatkowych etapów oczyszczania białek, które nie są wymagane w systemie B1H. Ponadto te techniki oparte na mikromacierzach są często wygórowane, ponieważ wymagają specjalnych urządzeń i wiedzy specjalistycznej do analizy uzyskanych danych. SELEX , inny system powszechnie stosowany do identyfikacji docelowych kwasów nukleinowych dla białek wiążących DNA, wymaga wielu rund selekcji. W przeciwieństwie do tego system jednej hybrydy bakteryjnej wymaga tylko jednej rundy selekcji in vitro i oferuje również mało zaawansowaną technologicznie alternatywę dla technologii opartych na mikromacierzach. Przeciwciała nie są wymagane do badania interakcji białek wiążących DNA w systemie B1H. Kolejną zaletą jest to, że system B1H działa nie tylko dla białek monomerycznych, ale także dla białek, które wiążą DNA jako kompleksy. System B1H należy uznać za specjalistyczną technikę badania interakcji DNA-białko, podczas gdy warianty dwuhybrydowe (B2H i Y2H ) mogą oceniać zarówno interakcje białko-białko, jak i białko-DNA. Te dwuhybrydowe systemy są wielozadaniowe, ale są ograniczone pod względem testowania tylko jednej biblioteki „zdobyczy”. Przewaga jednohybrydowego systemu bakteryjnego nad jednohybrydowym systemem drożdżowym (Y1H) polega na wyższej wydajności transformacji plazmidów w bakterie, co pozwala na badanie bardziej złożonych bibliotek „ofiar”.

Ograniczenia

Pomimo wspomnianych zalet jako narzędzia specjalistycznego, system B1H ma pewne wady. Po pierwsze, system selekcji B1H ma ograniczoną zdolność określania specyficzności wiązania czynników transkrypcyjnych z długimi miejscami wiązania. Wynika to z faktu, że liczba losowych klonów „ofiar” wymaganych do reprezentowania wszystkich możliwych sekwencji docelowych rośnie wykładniczo wraz z liczbą nukleotydów w tej sekwencji docelowej. Po drugie, niektóre czynniki eukariotyczne mogą nie ulegać skutecznej ekspresji lub fałdowaniu w systemie bakteryjnym, co przypisuje się różnym sieciom regulacyjnym i maszynerii transkrypcyjnej. Dlatego podczas pracy z białkami wiążącymi DNA pochodzenia eukariotycznego korzystny może być system hybrydowy oparty na drożdżach. Po trzecie, system B1H może nie być idealnie dopasowany do czynników transkrypcyjnych, które rozpoznają miejsca wiązania z niskim powinowactwem. Logika jest taka, że konkurencja stworzona przez miejsca wiązania w innym miejscu genomu bakteryjnego może ograniczać sygnał, który może być zrealizowany z pojedynczego miejsca wiązania, które jest obecne przed reporterem.

Aplikacja

System B1H zapewnia narzędzie w naszym arsenale do identyfikacji specyficzności wiązania DNA czynników transkrypcyjnych, a tym samym przewidywania ich genów docelowych i elementów regulacyjnych genomowego DNA. Pozwala również na badanie wpływu interakcji białko-białko na wiązanie DNA, co może dodatkowo kierować przewidywaniem modułów regulacyjnych cis w oparciu o grupowanie miejsc wiązania. Ponadto system selekcji B1H ma implikacje dla przewidywania ról regulacyjnych wcześniej niescharakteryzowanych czynników transkrypcyjnych.

Konkretne przykłady

Wykorzystując system jednej hybrydy bakteryjnej, w jednym badaniu scharakteryzowano 35 członków sieci segmentacji Drosophila melanogaster, która obejmuje reprezentatywnych członków wszystkich głównych klas białek domeny wiążącej DNA. Implikacje dla badań medycznych są oczywiste z innego badania, w którym wykorzystano system B1H do identyfikacji specyficzności wiązania DNA regulatora transkrypcji dla genu w Mycobacterium tuberculosis . System B1H został również wykorzystany do zidentyfikowania ważnego elementu obrotu w Escherichia coli.

Linki zewnętrzne