Gen reporterski
W biologii molekularnej gen reporterowy (często po prostu reporterowy ) to gen , który badacze przyłączają do sekwencji regulacyjnej innego genu będącego przedmiotem zainteresowania bakterii , hodowli komórkowej , zwierząt lub roślin. Takie geny nazywane są reporterami, ponieważ cechy, jakie nadają organizmom je wyrażającym, można łatwo zidentyfikować i zmierzyć, lub ponieważ są markerami selekcyjnymi . Geny reporterowe są często wykorzystywane jako wskaźnik tego, czy dany gen został wchłonięty przez populację komórek lub organizmu lub uległ w nim ekspresji.
Wspólne geny reporterowe
Aby wprowadzić gen reporterowy do organizmu, naukowcy umieszczają gen reporterowy i gen będący przedmiotem zainteresowania w tym samym konstrukcie DNA , który ma zostać wstawiony do komórki lub organizmu. W przypadku bakterii lub komórek prokariotycznych w hodowli ma to zwykle postać kolistej cząsteczki DNA zwanej plazmidem . W przypadku wirusów jest to tzw. wektor wirusowy . Ważne jest, aby zastosować gen reporterowy, który nie ulega natywnej ekspresji w badanej komórce lub organizmie, ponieważ ekspresja reportera jest wykorzystywana jako marker pomyślnego wychwytu genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Powszechnie stosowane geny reporterowe, które indukują cechy rozpoznawalne wizualnie, zwykle obejmują białka fluorescencyjne i luminescencyjne . Przykłady obejmują gen kodujący białko zielonej fluorescencji meduzy (GFP), które powoduje, że komórki wyrażające to białko świecą na zielono w niebieskim świetle, enzym lucyferaza , który katalizuje reakcję z lucyferyną w celu wytworzenia światła, oraz białko czerwonej fluorescencji z genu dsRed . GUS _ gen był powszechnie stosowany w roślinach, ale lucyferaza i GFP stają się coraz bardziej powszechne.
Powszechnym reporterem u bakterii jest gen lacZ E. coli , który koduje białko beta-galaktozydazę . Enzym ten powoduje, że bakterie wyrażające gen wydają się niebieskie, gdy rosną na podłożu zawierającym analog substratu X-gal . Przykładem markera selekcyjnego, który jest także reporterem u bakterii, jest acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT), który nadaje oporność na antybiotyk chloramfenikol .
| Imię genu | Produkt genowy | Analiza | Nr ref. |
|---|---|---|---|
| lacZ | β-galaktozydaza | Test enzymatyczny, histochemiczny | |
| kot | Acetylotransferaza chloramfenikolu | Acetylacja chloramfenikolu | |
| gfp | Zielone białko fluorescencyjne | Fluorescencyjny | |
| RFP | Czerwone białko fluorescencyjne | Mikroskopowe , spektrofotometryczne | |
| Luc | Enzym lucyferaza | Bioluminescencja |
Testy transformacji i transfekcji
Wiele metod transfekcji i transformacji – dwóch sposobów ekspresji obcego lub zmodyfikowanego genu w organizmie – jest skutecznych jedynie u niewielkiego odsetka populacji poddanej tym technikom. Zatem konieczna jest metoda identyfikacji tych kilku pomyślnych zdarzeń wychwytu genów. Geny reporterowe stosowane w ten sposób zwykle ulegają ekspresji pod wpływem własnego promotora (regionów DNA inicjujących transkrypcję genu) niezależnego od wprowadzonego genu będącego przedmiotem zainteresowania; gen reporterowy może ulegać konstytutywnej ekspresji (to znaczy jest „zawsze włączone”) lub indukowo za pomocą interwencji zewnętrznej, takiej jak wprowadzenie izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do układu β-galaktozydazy. W rezultacie ekspresja genu reporterowego jest niezależna od ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, co jest zaletą, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji jedynie w pewnych specyficznych warunkach lub w trudno dostępnych tkankach.
W przypadku reporterów markerów selekcyjnych, takich jak CAT, transfekowaną populację bakterii można hodować na podłożu zawierającym chloramfenikol . Tylko te komórki, które pomyślnie przyjęły konstrukt zawierający gen CAT, przeżyją i będą się rozmnażać w tych warunkach.
Testy ekspresji genów
Geny reporterowe można stosować do oznaczania ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania, który zwykle jest trudny do oznaczenia ilościowego. Geny reporterowe mogą wytwarzać białko, które ma niewielki oczywisty lub natychmiastowy wpływ na hodowlę komórkową lub organizm. W idealnym przypadku nie są one obecne w natywnym genomie, aby można było wyizolować ekspresję genu reporterowego w wyniku ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Aby aktywować geny reporterowe, można je wyrazić konstytutywnie , gdzie są bezpośrednio przyłączone do genu będącego przedmiotem zainteresowania, tworząc fuzję genów . Metoda ta jest przykładem wykorzystania działających w układzie cis , gdzie dwa geny znajdują się pod tymi samymi elementami promotora i ulegają transkrypcji do pojedynczej cząsteczki informacyjnego RNA . Następnie mRNA ulega translacji do białka . Ważne jest, aby oba białka mogły prawidłowo się fałdować w swoje aktywne konformacje i oddziałują z substratami pomimo stopienia. Podczas budowania konstruktu DNA zwykle włącza się odcinek DNA kodujący elastyczny region łącznika polipeptydowego, tak że reporter i produkt genu będą tylko w minimalnym stopniu kolidować ze sobą. Geny reporterowe można również wyrażać poprzez indukcję podczas wzrostu. W takich przypadkach do ekspresji genu reporterowego stosuje się elementy działające w pozycji trans , takie jak czynniki transkrypcyjne .
Test genu reporterowego jest coraz częściej stosowany w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych (HTS) w celu identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów i aktywatorów celów białkowych oraz ścieżek odkrywania leków i biologii chemicznej . Ponieważ same enzymy reporterowe (np. lucyferaza świetlika ) mogą być bezpośrednim celem małych cząsteczek i zakłócać interpretację danych HTS, opracowano nowe projekty reporterów koincydencji obejmujące tłumienie artefaktów.
Testy promotora
Geny reporterowe można stosować do oznaczania aktywności konkretnego promotora w komórce lub organizmie. W tym przypadku nie ma oddzielnego „genu będącego przedmiotem zainteresowania”; gen reporterowy po prostu umieszcza się pod kontrolą docelowego promotora i aktywność produktu genu reporterowego mierzy się ilościowo. Wyniki zwykle podaje się w odniesieniu do aktywności pod wpływem „konsensusowego” promotora, o którym wiadomo, że indukuje silną ekspresję genów.
Dalsze zastosowania
Bardziej złożone zastosowanie genów reporterowych na dużą skalę polega na badaniach przesiewowych dwuhybrydowych , których celem jest identyfikacja białek, które natywnie oddziałują ze sobą in vivo .
Zobacz też
Linki zewnętrzne
- Najważniejsze wyniki badań i aktualne informacje na temat genów reporterowych.
- Barwienie całych zarodków myszy pod kątem aktywności β-galaktozydazy (lacZ).