System sprawozdawczy GUS

Pylniki ryżu i styl pokazujący ekspresję GUS

System reporterowy GUS ( GUS : β-glukuronidaza ) jest systemem genów reporterowych , szczególnie przydatnym w biologii molekularnej i mikrobiologii roślin. Dostępnych jest kilka rodzajów testów genu reporterowego GUS , w zależności od zastosowanego substratu. Termin barwienie GUS odnosi się do najpowszechniejszej z nich, techniki histochemicznej.

Zamiar

Celem tej techniki jest analiza aktywności promotora transkrypcji genu ( pod kątem ekspresji tzw. włączony kontra wyłączony) poprzez wizualizację jego aktywności w różnych komórkach, tkankach lub narządach. Technika ta wykorzystuje gen uidA z Escherichia coli , który koduje enzym, β-glukuronidazę ; tego enzymu podczas inkubacji z określonymi substratami bezbarwnymi lub niefluorescencyjnymi , może przekształcić je w stabilne kolorowe lub fluorescencyjne produkty. Obecność koloru indukowanego przez GUS wskazuje, gdzie gen był aktywnie eksprymowany. W ten sposób silna aktywność promotora powoduje silne wybarwienie, a słaba aktywność promotora powoduje mniejsze wybarwienie.

Gen uidA można również połączyć z genem będącym przedmiotem zainteresowania, tworząc fuzję genów . Wstawienie genu uidA spowoduje wytwarzanie GUS, które można następnie wykryć przy użyciu różnych glukuronidów jako substratów.

Podłoża

Istnieją różne możliwe glukuronidy , które mogą być stosowane jako substraty dla β-glukuronidazy, w zależności od rodzaju potrzebnej detekcji ( histochemicznej , spektrofotometrycznej , fluorymetrycznej ). Najczęstszym substratem do barwienia histochemicznego GUS jest glukuronid 5-bromo-4-chloro-3-indolilu ( X-Gluc ). X-Gluc jest hydrolizowany przez GUS do produktu 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indygo (diX-indygo). DiX-indygo będzie miał kolor niebieski i będzie można go zobaczyć pod mikroskopem świetlnym. Proces ten jest analogiczny do hydrolizy X-gal przez beta-galaktozydazę w celu wytworzenia niebieskich komórek, co jest powszechnie praktykowane w bakteryjnych testach genów reporterowych.

W przypadku innych rodzajów wykrywania, powszechnymi substratami są p-nitrofenylo-β-D-glukuronid do testu spektrofotometrycznego i 4-metyloumbelliferylo-beta-D-glukuronid (MUG) do testu fluorymetrycznego.

Historia

System został pierwotnie opracowany przez Richarda Anthony'ego Jeffersona podczas jego doktoratu. na Uniwersytecie Kolorado w Boulder . Zaadaptował tę technikę do użytku z roślinami, pracując w Instytucie Hodowli Roślin w Cambridge w latach 1985-1987. Od tego czasu tysiące laboratoriów używało tego systemu, co czyni go jednym z najczęściej używanych narzędzi w biologii molekularnej roślin, ponieważ podkreślone przez tysiące cytowań w literaturze naukowej.

Zarodek ryżu wykazujący ekspresję GUS

Organizmy docelowe

Organizm nadaje się do testu GUS, jeśli nie ma naturalnie występującej aktywności β-glukuronidazy lub jeśli aktywność jest bardzo niska ( aktywność tła ). Z tego powodu test nie jest przydatny w przypadku większości kręgowców i wielu mięczaków . Ponieważ nie ma wykrywalnej aktywności GUS w roślinach wyższych , mchach , algach , paprociach , grzybach i większości bakterii , test idealnie nadaje się do badań ekspresji genów w tych organizmach i jest uważany za gen reporterowy z wyboru w naukach o roślinach.

Korzyści i ograniczenia

Test GUS nie wymaga do działania żadnych kofaktorów ani jonów. Beta-glukuronidaza może działać w szerokim zakresie wartości pH i jest dość odporna na inaktywację termiczną. Jednak GUS jest podatny na hamowanie przez pewne jony metali ciężkich, takie jak Cu ²⁺ i Zn ²⁺ .

Dodatkowo interpretacja testu jest ograniczona przez ruch diX-indygo w komórce. DiX-indygo może łączyć się z lipidami, aby dyfundować daleko od miejsca aktywności enzymu, co świadczy o braku lokalizacji w cytozolu i nieregularności penetracji substratu. Może to potencjalnie prowadzić do błędnej interpretacji lokalizacji białka GUS. Pomimo braku lokalizacji komórkowej, dobrze zaobserwowano lokalizację jądrową GUS. Testy GUS można przeprowadzić w obecności żelazicyjanku potasu, aby zapobiec dyfuzji plamy.

Inne systemy reporterskie

System GUS nie jest jedynym dostępnym systemem genów reporterowych do analizy aktywności promotora. Inne konkurencyjne układy oparte są np. na lucyferazie , GFP , beta-galaktozydazie , acetylotransferazie chloramfenikolu (CAT), fosfatazie alkalicznej . Zastosowanie jednego lub drugiego systemu zależy głównie od organizmu będącego przedmiotem zainteresowania oraz technologii obrazowania i mikroskopii dostępnych dla laboratoriów prowadzących badania.

Inne zastosowania

Warstwa aleuronowa nasion ryżu wykazująca ekspresję GUSPlus

Test GUS, jak również inne systemy genów reporterowych, mogą być stosowane do innych rodzajów badań innych niż klasyczny test aktywności promotora. Systemy reporterowe zostały wykorzystane do określenia wydajności systemów dostarczania genów, wewnątrzkomórkowej lokalizacji produktu genu, wykrywania interakcji białko-białko lub białko-DNA, wydajności sygnałów inicjacji translacji i powodzenia prób klonowania molekularnego.

Źródła

Bibliografia ^_^_ _ _ Kavanagh, TA; Bevan, MW (1987). „Fuzje GUS: beta-glukuronidaza jako czuły i wszechstronny marker fuzji genów w roślinach wyższych” . Dziennik EMBO . 6 (13): 3901–7. doi : 10.1002/j.1460-2075.1987.tb02730.x . PMC 553867 . PMID 3327686 .
Bibliografia _ Lambrecht, M.; Vanderleyden, J (1998). „Ruchliwość chemotaktyczna bakterii jest ważna dla zapoczątkowania kolonizacji korzeni pszenicy przez Azospirillum brasilense”. Mikrobiologia . 144 (9): 2599–606. doi : 10.1099/00221287-144-9-2599 . PMID 9782509 .
Bibliografia _ Ritzenthaler, P; Mata-Gilsinger, M (1982). „Klonowanie i analiza restrykcyjna endonukleazy genów uidA i uidR w Escherichia coli K-12: Określenie kierunku transkrypcji genu uidA” . Journal of Bacteriology . 149 (2): 587–94. doi : 10.1128/JB.149.2.587-594.1982 . PMC 216546 . PMID 6276362 .
^ ^a ^b Jefferson, RA; Burgess SM; Hirsh, D (1986). „Beta-glukuronidaza z Escherichia coli jako marker fuzji genów” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 83 (22): 8447–51. Bibcode : 1986PNAS...83.8447J . doi : 10.1073/pnas.83.22.8447 . PMC 386947 . PMID 3534890 .
^ ^abc ^Guivarc'h ^, A.; Caissard, JC; Azmi, A.; Elmayan, T.; Chriqui, D.; Tepfer, M. (1996-09-01). „Wykrywanie in situ ekspresji genu reporterowego thegus w roślinach transgenicznych: dziesięć lat niebieskich genów” . Badania transgeniczne . 5 (5): 281–288. doi : 10.1007/BF01968938 . ISSN 1573-9368 . S2CID 21151079 .
^ ^a ^b ^c Patent USA 5 268 463
^ ^a ^{b Witryna organizacji} Cambia : biografia Richarda A. Jeffersona zarchiwizowana 19.08.2006 w Wayback Machine
^ Jefferson, Richard A. (1987-12-01). „Badanie genów chimerycznych w roślinach: system fuzji genów GUS” . Reporter biologii molekularnej roślin . 5 (4): 387–405. doi : 10.1007/BF02667740 . ISSN 1572-9818 . S2CID 5619830 .
^ Caissard, Jean-Claude; Guivarc'h, Anna; Rembur, Jakub; Azmi, Abdelkrim; Chriqui, Dominik (1994-05-01). „Fałszywe lokalizacje mikrokryształów diX-indygo generowanych przez histochemiczny test GUS” . Badania transgeniczne . 3 (3): 176–181. doi : 10.1007/BF01973985 . ISSN 1573-9368 . S2CID 797978 .
^ Citowski, W.; Zupan, J.; Warnick, D.; Zambryski, P. (1992-06-26). „Jądrowa lokalizacja białka Agrobacterium VirE2 w komórkach roślinnych” . nauka . 256 (5065): 1802–1805. Bibcode : 1992Sci...256.1802C . doi : 10.1126/science.1615325 . ISSN 0036-8075 . PMID 1615325 .

[GUS_in_plants-1] Bibliografia ^_^_ _ _ Kavanagh, TA; Bevan, MW (1987). „Fuzje GUS: beta-glukuronidaza jako czuły i wszechstronny marker fuzji genów w roślinach wyższych” . Dziennik EMBO . 6 (13): 3901–7. doi : 10.1002/j.1460-2075.1987.tb02730.x . PMC 553867 . PMID 3327686 .

[GUS_in_microbes-2] Bibliografia _ Lambrecht, M.; Vanderleyden, J (1998). „Ruchliwość chemotaktyczna bakterii jest ważna dla zapoczątkowania kolonizacji korzeni pszenicy przez Azospirillum brasilense”. Mikrobiologia . 144 (9): 2599–606. doi : 10.1099/00221287-144-9-2599 . PMID 9782509 .

[3] Bibliografia _ Ritzenthaler, P; Mata-Gilsinger, M (1982). „Klonowanie i analiza restrykcyjna endonukleazy genów uidA i uidR w Escherichia coli K-12: Określenie kierunku transkrypcji genu uidA” . Journal of Bacteriology . 149 (2): 587–94. doi : 10.1128/JB.149.2.587-594.1982 . PMC 216546 . PMID 6276362 .

[original_paper-4] Jefferson, RA; Burgess SM; Hirsh, D (1986). „Beta-glukuronidaza z Escherichia coli jako marker fuzji genów” . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 83 (22): 8447–51. Bibcode : 1986PNAS...83.8447J . doi : 10.1073/pnas.83.22.8447 . PMC 386947 . PMID 3534890 .

[:0-5] Guivarc'h ^, A.; Caissard, JC; Azmi, A.; Elmayan, T.; Chriqui, D.; Tepfer, M. (1996-09-01). „Wykrywanie in situ ekspresji genu reporterowego thegus w roślinach transgenicznych: dziesięć lat niebieskich genów” . Badania transgeniczne . 5 (5): 281–288. doi : 10.1007/BF01968938 . ISSN 1573-9368 . S2CID 21151079 .

[patent1-6] Patent USA 5 268 463

[cambia-7] {b Witryna organizacji} Cambia : biografia Richarda A. Jeffersona zarchiwizowana 19.08.2006 w Wayback Machine

[8] Jefferson, Richard A. (1987-12-01). „Badanie genów chimerycznych w roślinach: system fuzji genów GUS” . Reporter biologii molekularnej roślin . 5 (4): 387–405. doi : 10.1007/BF02667740 . ISSN 1572-9818 . S2CID 5619830 .

[9] Caissard, Jean-Claude; Guivarc'h, Anna; Rembur, Jakub; Azmi, Abdelkrim; Chriqui, Dominik (1994-05-01). „Fałszywe lokalizacje mikrokryształów diX-indygo generowanych przez histochemiczny test GUS” . Badania transgeniczne . 3 (3): 176–181. doi : 10.1007/BF01973985 . ISSN 1573-9368 . S2CID 797978 .

[10] Citowski, W.; Zupan, J.; Warnick, D.; Zambryski, P. (1992-06-26). „Jądrowa lokalizacja białka Agrobacterium VirE2 w komórkach roślinnych” . nauka . 256 (5065): 1802–1805. Bibcode : 1992Sci...256.1802C . doi : 10.1126/science.1615325 . ISSN 0036-8075 . PMID 1615325 .