Systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacenie

Schemat głównych faz eksperymentu SELEX. Cykl ten można powtarzać do 20 razy w ciągu tygodni, chociaż niektóre metody wymagają znacznie mniejszej liczby cykli.
Struktura aptameru RNA specyficznego dla biotyny . Powierzchnia aptameru i szkielet są pokazane na żółto. Biotyna (kulki) ściśle przylega do wnęki powierzchni RNA.

Systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacanie wykładnicze ( SELEX ), określana również jako selekcja in vitro lub ewolucja in vitro , jest kombinatoryczną techniką chemii w biologii molekularnej do wytwarzania oligonukleotydów z jednoniciowego DNA lub RNA , które specyficznie wiążą się z docelowym ligandem lub ligandy. Te jednoniciowe DNA lub RNA są powszechnie określane jako aptamery . Chociaż SELEX stał się najczęściej używaną nazwą procedury, niektórzy badacze określają ją jako SAAB (wybrane i amplifikowane miejsce wiązania) oraz CASTing (cykliczna amplifikacja i selekcja celów). SELEX został po raz pierwszy wprowadzony w 1990 r. W 2015 r. ukazał się specjalny numer w Journal of Molecular Evolution z okazji ćwierćwiecza odkrycia SELEX-u.

Proces rozpoczyna się od syntezy bardzo dużej biblioteki oligonukleotydów, składającej się z losowo generowanych sekwencji o ustalonej długości, flankowanych przez stałe końce 5' i 3' . Stałe końce służą jako startery , podczas gdy oczekuje się, że niewielka liczba losowych regionów zwiąże się specyficznie z wybranym celem. Dla losowo wygenerowanego regionu o długości n liczba możliwych sekwencji w bibliotece przy użyciu konwencjonalnego DNA lub RNA wynosi 4 n ( n pozycje z czterema możliwościami (A,T,C,G) w każdej pozycji). Sekwencje w bibliotece są eksponowane na docelowy ligand - którym może być białko lub mały związek organiczny - a te, które nie wiążą się z celem są usuwane, zwykle przez chromatografię powinowactwa lub wychwytywanie celu na kulkach paramagnetycznych. Związane sekwencje eluuje się i amplifikuje metodą PCR aby przygotować się do kolejnych rund selekcji, w których surowość warunków elucji może zostać zwiększona w celu zidentyfikowania najściślej wiążących sekwencji. Ostrożność, którą należy wziąć pod uwagę w tej metodzie, polega na tym, że wybór jednostek o wyjątkowo wysokim, subnanomolowym powinowactwie wiązania może w rzeczywistości nie poprawić specyficzności cząsteczki docelowej. Wiązanie poza celem z pokrewnymi cząsteczkami może mieć znaczące skutki kliniczne.

SELEX został wykorzystany do opracowania wielu aptamerów, które wiążą cele interesujące zarówno do celów klinicznych, jak i badawczych. Nukleotydy z chemicznie modyfikowanymi cukrami i zasadami zostały włączone do reakcji SELEX w celu zwiększenia różnorodności chemicznej każdej zasady, rozszerzając możliwości specyficznego i czułego wiązania lub zwiększając stabilność w surowicy lub in vivo .

Procedura

Aptamery pojawiły się jako nowa kategoria w dziedzinie bioreceptorów ze względu na ich szerokie zastosowanie, od bioczujników po terapie. Zgłoszono kilka odmian ich procesu przeszukiwania, zwanych SELEX, które mogą dać sekwencje o pożądanych właściwościach potrzebnych do ich ostatecznego zastosowania.

Generowanie biblioteki jednoniciowych oligonukleotydów

Pierwszy etap SELEX obejmuje syntezę w pełni lub częściowo losowych sekwencji oligonukleotydowych o pewnej długości, otoczonych przez określone regiony, które umożliwiają amplifikację PCR tych losowych regionów oraz, w przypadku RNA SELEX, transkrypcję in vitro randomizowanej sekwencji. Podczas gdy Ellington i Szostak wykazali, że synteza chemiczna jest w stanie wytworzyć ~10 15 unikalnych sekwencji dla bibliotek oligonukleotydów w swoim artykule z 1990 roku na temat selekcji in vitro, stwierdzili, że amplifikacja tych zsyntetyzowanych oligonukleotydów doprowadziła do znacznej utraty różnorodności puli z powodu błędu PCR i defektów w syntetyzowanych fragmentach. Pulę oligonukleotydów amplifikuje się i do reakcji dodaje się wystarczającą ilość początkowej biblioteki, tak aby istniały liczne kopie każdej pojedynczej sekwencji, aby zminimalizować utratę potencjalnych sekwencji wiążących z powodu zdarzeń stochastycznych. Zanim biblioteka zostanie wprowadzona do celu w celu inkubacji i selektywnej retencji, biblioteka sekwencji musi zostać przekształcona w jednoniciowe oligonukleotydy w celu uzyskania konformacji strukturalnych o właściwościach wiązania celu.

Inkubacja celu

Bezpośrednio przed wprowadzeniem celu, biblioteka jednoniciowych oligonukleotydów jest często podgrzewana i powoli schładzana w celu renaturyzowania oligonukleotydów w stabilne termodynamicznie struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe. Po przygotowaniu, randomizowana biblioteka jest inkubowana z unieruchomionym celem, aby umożliwić wiązanie oligonukleotydu z celem. Istnieje kilka kwestii związanych z tym docelowym etapem inkubacji, w tym metoda unieruchamiania celu i strategie późniejszego rozdzielania niezwiązanych oligonukleotydów, czas i temperatura inkubacji, warunki buforowe do inkubacji oraz stężenia docelowe względem oligonukleotydów. Przykłady docelowych sposobów immobilizacji obejmują kolumny do chromatografii powinowactwa , filtry do oznaczania wiązania nitrocelulozy i kulki paramagnetyczne. Ostatnio opracowano reakcje SELEX, w których celem są całe komórki, które namnaża się w pobliżu całkowitej konfluencji i inkubuje z biblioteką oligonukleotydów na płytkach hodowlanych. Warunki buforowe do inkubacji są zmieniane w zależności od zamierzonego celu i pożądanej funkcji wybranego aptameru. Na przykład w przypadku ujemnie naładowanych małych cząsteczek i białek do przesiewania ładunku stosuje się bufory o wysokiej zawartości soli aby umożliwić nukleotydom zbliżenie się do celu i zwiększyć szansę na specyficzne zdarzenie wiązania. Alternatywnie, jeśli pożądaną funkcją aptameru jest in vivo wiązanie białka lub całych komórek do potencjalnego zastosowania terapeutycznego lub diagnostycznego, bardziej prawdopodobne jest, że warunki buforu do inkubacji podobne do stężeń soli w osoczu in vivo i temperatur homeostatycznych z większym prawdopodobieństwem wygenerują aptamery, które mogą wiązać się in vivo. Inną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę w warunkach buforowych inkubacji, są niespecyficzni konkurenci. Jeżeli istnieje duże prawdopodobieństwo retencji niespecyficznych oligonukleotydów w warunkach reakcji, do zajęcia tych niespecyficznych oligonukleotydów można zastosować nieswoistych konkurentów, którymi są małe cząsteczki lub polimery inne niż biblioteka SELEX, które mają podobne właściwości fizyczne do oligonukleotydów biblioteki. specyficzne miejsca wiązania. Zmiana względnego stężenia celu i oligonukleotydów może również wpływać na właściwości wybranych aptamerów. Jeśli dobry powinowactwo wiązania wybranego aptameru nie stanowi problemu, wówczas można zastosować nadmiar celu w celu zwiększenia prawdopodobieństwa, że ​​przynajmniej niektóre sekwencje zwiążą się podczas inkubacji i zostaną zachowane. Jednak nie zapewnia to presji selekcyjnej dla wysokiego powinowactwa wiązania , co wymaga nadmiaru biblioteki oligonukleotydów, tak aby istniała rywalizacja między unikalnymi sekwencjami o dostępne specyficzne miejsca wiązania.

Elucja i amplifikacja sekwencji wiążącej

Gdy biblioteka oligonukleotydów była inkubowana z celem przez wystarczający czas, niezwiązane oligonukleotydy są wypłukiwane z unieruchomionego celu, często przy użyciu buforu do inkubacji, tak że specyficznie związane oligonukleotydy są zatrzymywane. Po wypłukaniu niezwiązanych sekwencji, specyficznie związane sekwencje są następnie eluowane poprzez stworzenie warunków denaturujących, które sprzyjają rozwijaniu się oligonukleotydu lub utracie konformacji wiązania, w tym poprzez przepływ w wodzie dejonizowanej, przy użyciu roztworów denaturujących zawierających mocznik i EDTA lub przez zastosowanie wysokiej temperatury i siły fizycznej. Po elucji związanych sekwencji, zachowane oligonukleotydy poddawane są odwrotnej transkrypcji do DNA w przypadku selekcji RNA lub zmodyfikowanych zasad lub po prostu zebrane do amplifikacji w przypadku DNA SELEX. Te matryce DNA z eluowanych sekwencji są następnie amplifikowane za pomocą PCR i przekształcane w jednoniciowe DNA, RNA lub zmodyfikowane oligonukleotydy zasadowe, które są używane jako początkowe dane wejściowe do następnej rundy selekcji.

Uzyskanie ssDNA

Jednym z najbardziej krytycznych etapów procedury SELEX jest uzyskanie jednoniciowego DNA (ssDNA) po etapie amplifikacji PCR. Posłuży to jako dane wejściowe do następnego cyklu, dlatego niezwykle ważne jest, aby całe DNA było jednoniciowe i jak najmniej zostało utracone. Ze względu na względną prostotę, jedną z najczęściej stosowanych metod jest użycie biotynylowanych starterów odwrotnych w etapie amplifikacji, po którym komplementarne nici można związać z żywicą, a następnie eluować drugą nić ługiem. Inną metodą jest asymetryczny PCR, w którym etap amplifikacji przeprowadza się z nadmiarem startera przedniego i bardzo małym starterem wstecznym, co prowadzi do wytworzenia większej ilości pożądanej nici. Wadą tej metody jest konieczność oczyszczenia produktu z dwuniciowego DNA (dsDNA) i innego materiału pozostałego po reakcji PCR. Degradacja enzymatyczna niechcianej nici może być przeprowadzona przez znakowanie tej nici za pomocą startera z sondą fosforanową, ponieważ jest rozpoznawana przez enzymy, takie jak egzonukleaza lambda . Enzymy te następnie selektywnie degradują nić znakowaną fosforanem, pozostawiając nienaruszoną nić komplementarną. Wszystkie te metody umożliwiają odzyskanie około 50 do 70% DNA. Szczegółowe porównanie można znaleźć w artykule Svobodovej i in. gdzie te i inne metody są eksperymentalnie porównywane. W klasycznym SELEX, opisany powyżej proces generowania randomizowanej biblioteki jednoniciowej, inkubacji docelowej oraz elucji i amplifikacji sekwencji wiążącej jest powtarzany, aż zdecydowana większość zachowanej puli składa się z sekwencji wiążących cel, chociaż istnieją modyfikacje i dodatki do procedury, które są często używane, co omówiono poniżej.

Wybór negatywny lub licznik

W celu zwiększenia specyficzności aptamerów wyselekcjonowanych w danej procedurze SELEX, przed inkubacją celu lub bezpośrednio po niej można dodać etap selekcji negatywnej lub kontrselekcji. Aby wyeliminować z puli sekwencje z powinowactwem do docelowych składników macierzy unieruchamiania, można zastosować selekcję negatywną, w której bibliotekę inkubuje się ze składnikami docelowej macierzy unieruchamiania i niezwiązane sekwencje są zachowane. Selekcję negatywną można również zastosować do wyeliminowania sekwencji, które wiążą cząsteczki lub komórki podobne do celu przez inkubację biblioteki oligonukleotydów z docelowymi analogami małocząsteczkowymi, niepożądanymi typami komórek lub białkami niedocelowymi i zachowaniem niezwiązanych sekwencji.

Śledzenie postępu wyboru

Aby śledzić postęp reakcji SELEX, liczbę cząsteczek związanych z celem, która jest równoważna liczbie eluowanych oligonukleotydów, można porównać z szacowanym całkowitym wkładem oligonukleotydów po elucji w każdej rundzie. Liczbę eluowanych oligonukleotydów można oszacować poprzez oszacowanie stężenia elucji za pomocą absorbancji długości fali 260 nm lub znakowania fluorescencyjnego oligonukleotydów. Gdy reakcja SELEX zbliża się do końca, frakcja biblioteki oligonukleotydów, która wiąże cel, zbliża się do 100%, tak że liczba eluowanych cząsteczek zbliża się do oszacowania całkowitego wejściowego oligonukleotydu, ale może zbiegać się przy niższej liczbie.

Zastrzeżenia i rozważania

Niektóre reakcje SELEX mogą generować sondy, które są zależne od regionów wiążących startery do tworzenia struktury drugorzędowej. Istnieją zastosowania aptameru, dla których pożądana jest krótka sekwencja, a tym samym skrócenie startera. Postęp w stosunku do oryginalnej metody pozwala bibliotece RNA pominąć stałe regiony starterów, które mogą być trudne do usunięcia po procesie selekcji, ponieważ stabilizują struktury drugorzędowe , które są niestabilne, gdy są tworzone przez sam losowy region.

Chemicznie modyfikowane nukleotydy

Ostatnio SELEX rozszerzył się o zastosowanie chemicznie modyfikowanych nukleotydów. Te chemicznie modyfikowane oligonukleotydy oferują wiele potencjalnych korzyści dla wybranych aptamerów, w tym większą stabilność i odporność na nukleazy, zwiększone wiązanie dla wybranych celów, rozszerzone właściwości fizyczne - takie jak zwiększona hydrofobowość i bardziej zróżnicowane konformacje strukturalne.

Alfabet genetyczny, a tym samym możliwe aptamery, jest również rozszerzany przy użyciu nienaturalnych par zasad. Zastosowanie tych nienaturalnych par zasad zastosowano w SELEX i wygenerowano aptamery DNA o wysokim powinowactwie.

Warianty SELEX i alternatywne metody selekcji aptamerów

FRELEX został opracowany w 2016 roku przez NeoVentures Biotechnology Inc , aby umożliwić selekcję aptamerów bez immobilizacji celu lub biblioteki oligonukleotydów. Unieruchomienie jest niezbędnym elementem SELEX; ma jednak potencjał hamowania kluczowych epitopów , a tym samym osłabiają prawdopodobieństwo pomyślnego wiązania, szczególnie podczas pracy z małymi cząsteczkami. FRELEX stosuje podobną ogólną metodologię jak SELEX; jednak zamiast unieruchamiania celu, badacz wprowadza serię losowych i blokujących oligonukleotydów do pola unieruchamiania przed wprowadzeniem do celu. Pozwala to naukowcowi lepiej celować w małe cząsteczki, które mogą zostać utracone podczas podziału. Można go również użyć w pewnych okolicznościach do wybrania biblioteki aptamerów bez znajomości celu.

Wcześniejsze cele

Technika ta została wykorzystana do wyewoluowania aptamerów o niezwykle wysokim powinowactwie wiązania z różnymi docelowymi ligandami, w tym małymi cząsteczkami , takimi jak ATP i adenozyna , oraz białkami, takimi jak priony i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Ponadto SELEX zastosowano do selekcji aptamerów o wysokim powinowactwie do złożonych celów, takich jak komórki nowotworowe, egzosomy nowotworowe lub tkanka nowotworowa. Kliniczne zastosowania tej techniki są sugerowane przez aptamery, które wiążą markery nowotworowe , fluorofory związane z GFP , a aptamer wiążący VEGF o nazwie handlowej Macugen został zatwierdzony przez FDA do leczenia zwyrodnienia plamki żółtej . Dodatkowo SELEX został wykorzystany do uzyskania wysoce specyficznego katalitycznego DNA lub DNAzymów. Zgłoszono kilka DNAzymów specyficznych dla metali, w tym DNAzym GR-5 (specyficzny dla ołowiu), DNAzym CA1-3 (specyficzny dla miedzi), DNAzym 39E (specyficzny dla uranylu) i DNAzym NaA43 (specyficzny dla sodu).

Te opracowane aptamery znalazły różnorodne zastosowanie w terapiach zwyrodnienia plamki żółtej i różnych zastosowaniach badawczych, w tym w bioczujnikach , znakowaniu fluorescencyjnym białek i komórek oraz selektywnym hamowaniu enzymów.

Zobacz też

Dalsza lektura

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Systematic_evolution_of_ligands_by_exponential_enrichment&oldid=1143977152 ”