Biotechnologia w produkcji farmaceutycznej

Bakterie Escherichia coli, które są często wykorzystywane do produkcji wyrobów farmaceutycznych.

Nowoczesne techniki produkcji farmaceutycznej często opierają się na biotechnologii .

Insulina ludzka

Kryształy insuliny

Jednym z najwcześniejszych zastosowań biotechnologii w produkcji farmaceutycznej jest wykorzystanie technologii rekombinacji DNA do modyfikacji bakterii Escherichia coli w celu produkcji ludzkiej insuliny , co zostało przeprowadzone w Genentech w 1978 r. Przed opracowaniem tej techniki insulinę ekstrahowano z gruczołów trzustkowych bydło, świnie i inne zwierzęta hodowlane. Chociaż ogólnie jest skuteczna w leczeniu cukrzycy , insulina pochodzenia zwierzęcego nie jest nie do odróżnienia od insuliny ludzkiej i dlatego może wywoływać reakcje alergiczne. Naukowcy z Genentech stworzyli sztuczne geny dla każdego z dwóch łańcuchów białkowych , które składają się na cząsteczkę insuliny. Sztuczne geny zostały „wstawione… do plazmidów… wśród grupy genów, które” są aktywowane przez laktozę . Zatem geny produkujące insulinę były również aktywowane przez laktozę. Zrekombinowane plazmidy wstawiono do bakterii Escherichia coli , które „zaindukowano do produkcji 100 000 cząsteczek insuliny ludzkiej o łańcuchu A lub łańcuchu B”. Dwa łańcuchy białkowe zostały następnie połączone w celu wytworzenia cząsteczek insuliny.

Ludzki hormon wzrostu

Hormon wzrostu

Przed zastosowaniem technologii rekombinacji DNA do modyfikowania bakterii w celu wytworzenia ludzkiego hormonu wzrostu hormon ten był wytwarzany poprzez ekstrakcję z przysadki mózgowej zwłok, ponieważ zwierzęce hormony wzrostu nie mają wartości terapeutycznej u ludzi. Wyprodukowanie rocznego zapasu ludzkiego hormonu wzrostu wymagało aż pięćdziesięciu przysadek mózgowych, powodując znaczne niedobory tego hormonu. W 1979 roku naukowcy z Genentech wyprodukowali ludzki hormon wzrostu poprzez wstawienie DNA kodującego ludzki hormon wzrostu do plazmidu wszczepionego Escherichia coli . Gen, który wprowadzono do plazmidu, powstał w wyniku odwrotnej transkrypcji mRNA znajdującego się w przysadce mózgowej do komplementarnego DNA. HaeIII, rodzaj enzymu restrykcyjnego, który działa w miejscach restrykcyjnych „w regionie niekodującym 3'” i w 23 . aminokwasy 24-191 HGH”. Następnie wytworzono „chemicznie zsyntetyzowany fragment adaptera DNA zawierający kodon inicjacji ATG…” z kodonami dla aminokwasów od pierwszego do 23 w ludzkim hormonie wzrostu. „Dwa fragmenty DNA… [zostały] połączone w celu utworzenia syntetyczno-naturalnego„ hybrydowego ”genu”. Wykorzystanie całkowicie syntetycznych metod produkcji DNA do wytworzenia genu, który uległby translacji na ludzki hormon wzrostu w escherichia coli, byłoby niezwykle pracochłonne ze względu na znaczną długość sekwencji aminokwasowej ludzkiego hormonu wzrostu. Jeśli jednak cDNA poddane odwrotnej transkrypcji z mRNA dla ludzkiego hormonu wzrostu zostanie wstawione bezpośrednio do plazmidu wstawionego do escherichia coli, bakterie dokonałyby translacji regionów genu, które nie ulegają translacji u ludzi, wytwarzając w ten sposób „prehormon zawierający dodatkowe 26 aminokwasów”, które mogą być trudne do usunięcia.

Ludzkie czynniki krzepnięcia krwi

Przed opracowaniem i zatwierdzeniem przez FDA sposobu wytwarzania ludzkich czynników krzepnięcia krwi przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ludzkie czynniki krzepnięcia krwi były wytwarzane z krwi dawców, która nie została odpowiednio przebadana pod kątem HIV . Zatem zakażenie wirusem HIV stanowiło poważne zagrożenie dla pacjentów z hemofilią , którzy otrzymywali ludzkie czynniki krzepnięcia krwi:

Większość doniesień wskazuje, że 60 do 80 procent pacjentów z hemofilią, którzy byli narażeni na działanie koncentratów czynnika VIII w latach 1979-1984, jest seropozytywnych w kierunku HIV w teście Western blot. W maju 1988 roku ponad 659 pacjentów z hemofilią miało AIDS...

Pierwszym ludzkim czynnikiem krzepnięcia krwi, który został wyprodukowany w znacznych ilościach przy użyciu technologii rekombinacji DNA, był czynnik IX , który został wyprodukowany przy użyciu transgenicznych komórek jajnika chomika chińskiego w 1986 r. Nie mając mapy ludzkiego genomu, naukowcy uzyskali znaną sekwencję RNA dla czynnika IX poprzez badanie aminokwasów w czynniku IX:

Mikrosekwencjonowanie wysoce oczyszczonego... [czynnika IX] dało wystarczającą sekwencję aminokwasową do skonstruowania sond oligonukleotydowych.

Znana sekwencja RNA czynnika IX została następnie wykorzystana do poszukiwania genu kodującego czynnik IX w bibliotece DNA znalezionej w ludzkiej wątrobie, ponieważ wiadomo było, że czynniki krzepnięcia krwi są wytwarzane przez ludzką wątrobę:

Unikalny oligonukleotyd... homologiczny do mRNA czynnika IX... został zsyntetyzowany i oznakowany... Powstała sonda została użyta do przeszukiwania biblioteki dwuniciowego cDNA ludzkiej wątroby... Kompletne dwuniciowe sekwencje DNA... [odpowiedni] cDNA… zawierał całą sekwencję kodującą na końcu COOH jedenastego kodonu (11) i całą nieulegającą translacji sekwencję 3'.

Ta sekwencja cDNA została wykorzystana do znalezienia pozostałych sekwencji DNA zawierających gen czynnika IX poprzez przeszukanie DNA w chromosomie X:

Przygotowano bibliotekę genomową z ludzkiego chromosomu XXXX... i przeszukano ją sondą cDNA czynnika IX. Wyizolowano hybrydyzującego zrekombinowanego faga, oczyszczono z łysinek i wyizolowano DNA. Mapowanie restrykcyjne, analiza Southerna i sekwencjonowanie DNA umożliwiły identyfikację pięciu rekombinowanych wstawek zawierających faga, które po nałożeniu na wspólne sekwencje kodowały cały gen czynnika IX o długości 35 kb.

Plazmidy zawierające gen czynnika IX wraz z plazmidami z genem kodującym oporność na metotreksat wprowadzono poprzez transfekcję do komórek jajnika chomika chińskiego. Transfekcja polega na wprowadzeniu DNA do komórki eukariotycznej. W przeciwieństwie do analogicznego procesu transformacji w bakteriach, transfekowany DNA zwykle nie jest integrowany z genomem komórki, a zatem zwykle nie jest przekazywany kolejnym pokoleniom poprzez podział komórki. Tak więc, aby uzyskać „stabilną” transfekcję, należy również transfekować gen, który zapewnia znaczną przewagę przeżycia, powodując, że kilka komórek, które zintegrowały transfekowany DNA ze swoimi genomami, zwiększyło swoją populację jako komórki, które nie zintegrowały DNA są eliminowane. W przypadku tego badania „wzrost [th] w rosnących stężeniach metotreksatu” sprzyjał przeżywalności stabilnie transfekowanych komórek i zmniejszał przeżywalność innych komórek.

Komórki jajnika chomika chińskiego, które zostały stabilnie transfekowane, wytwarzały znaczne ilości czynnika IX, który, jak wykazano, ma istotne właściwości koagulacyjne, chociaż w mniejszym stopniu niż czynnik IX wytwarzany z ludzkiej krwi:

Aktywność właściwą rekombinowanego czynnika IX zmierzono na podstawie bezpośredniego pomiaru aktywności koagulacyjnej... Aktywność właściwa rekombinowanego czynnika IX wyniosła 75 jednostek/mg... w porównaniu do 150 jednostek/mg zmierzonych dla czynnika pochodzenia osoczowego IX...

W 1992 roku FDA zatwierdziła czynnik VIII wytwarzany przy użyciu transgenicznych komórek jajnika chomika chińskiego, pierwszy taki czynnik krzepnięcia krwi wyprodukowany przy użyciu technologii rekombinacji DNA, który został zatwierdzony.

Transgeniczne zwierzęta hodowlane

Świnia, której transgeniczne pokolenia mogą być użyte do produkcji substytutów krwi do stosowania u ludzi.

Techniki rekombinacji DNA zostały również wykorzystane do stworzenia transgenicznych zwierząt hodowlanych, które mogą wytwarzać produkty farmaceutyczne do stosowania u ludzi. Na przykład stworzono świnie produkujące ludzką hemoglobinę. Podczas gdy krew takich świń nie mogła być bezpośrednio wykorzystana do transfuzji dla ludzi, hemoglobina mogła zostać oczyszczona i wykorzystana do wytworzenia substytutu krwi.

paklitaksel (taksol)

Firma Bristol-Myers Squibb wytwarza paklitaksel przy użyciu Penicillium raistrickii i fermentacji komórek roślinnych (PCF). ^{[ potrzebne źródło ]}

Artemizyna

Drożdże transgeniczne są wykorzystywane do produkcji artemizyniny , a także wielu analogów insuliny .

Zobacz też