Cdc14
Cdc14 i Cdc14 są odpowiednio genem i jego produktem białkowym. Cdc14 występuje u większości eukariotów. Cdc14 został zdefiniowany przez Hartwella w jego słynnym badaniu loci kontrolujących cykl komórkowy Saccharomyces cerevisiae . Później wykazano, że Cdc14 koduje fosfatazę białkową . Cdc14 ma podwójną specyficzność, co oznacza, że ma aktywność ukierunkowaną na serynę/treoninę i tyrozynę. Zgłoszono preferencje dla seryny obok proliny. Wiele wczesnych badań, zwłaszcza na pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae, wykazało, że białko to odgrywa kluczową rolę w regulacji późnych mitotycznych . Jednak nowsze prace w szeregu systemów sugerują, że jego funkcja komórkowa jest bardziej złożona.
Funkcja komórkowa
W Saccharomyces cerevisiae, gatunku, u którego aktywność Cdc14 jest najlepiej poznana i najlepiej zbadana, aktywność Cdc14 (ScCdc14) prowadzi do wyjścia mitotycznego przez defosforylację celów Cdk1, dobrze zbadanej kinazy białkowej zależnej od cyklin . Cdc14 antagonizuje Cdk1, stymulując proteolizę swojego partnera cykliny (cykliny B), poprzez defosforylację Cdh1, regulatora kompleksu promującego anafazę . Cdc14 defosforyluje również Swi5 w celu zwiększenia transkrypcji Sic1, inhibitora Cdk1.
Ten „prosty” model wyjścia mitotycznego stał się skomplikowany, ponieważ ScCdc14 przypisywano dodatkowe role w mitozie. Obejmowały one stabilizację wrzeciona i regulację cytokinezy oraz segregacji rDNA/telomerów. Stwierdzono, że zgodnie z tak wieloma rolami, ScCdc14 wiąże kilka białek, które regulują cykl komórkowy i replikację DNA lub łączą się z wrzecionem lub kinetochorem.
Prace nad innymi drożdżami jeszcze bardziej skomplikowały zrozumienie roli Cdc14. Mutanty w ortologu rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe normalnie wychodzą z mitozy (w przeciwieństwie do S. cerevisiae), ale mają zmienioną przegrodę i cytokinezę. Ponadto, chociaż białko reguluje ortolog Cdk1 S. pombe, dzieje się to w procesie innym niż u S. cerevisiae; nie defosforyluje ortologów Sic1 lub Cdh1, ale sprzyja inaktywacji Cdc2 poprzez regulację w dół fosfatazy Cdc25. Cdc14 z Candida albicans jest również zaangażowany w septację i cytokinezę, ale nie w wyjście mitotyczne.
Badania Cdc14 w systemach zwierzęcych jeszcze bardziej zagmatwały historię Cdc14. Zwierzęta mają do trzech rozbieżnych genów Cdc14, z wieloma wariantami składania, które wydają się różnić pod względem funkcji i lokalizacji. Ponadto kilka kluczowych badań przyniosło sprzeczne wyniki. Nicienie Caenorhabditis elegans wytwarzają jeden Cdc14 (CeCdc14), który lokalizuje się w wrzecionie i centrosomach w mitozie oraz w cytoplazmie w interfazie. Jedno badanie RNAi z CeCdc14 spowodowało defekty cytokinezy, co było zgodne z podobną pracą w Xenopus laevis . Jednak drugie badanie RNAi nie wykazało żadnych defektów i zasugerowano, że w pierwszym eksperymencie użyto zbyt wielu oligonukleotydów, co spowodowało efekty niezgodne z celem. Istnieją również sprzeczne dane dotyczące ludzkiego Cdc14. W przeciwieństwie do CeCdc14, hCdc14A nie jest centrosomowy w mitozie, ale jest cytoplazmatyczny i centrosomowy podczas interfazy. W jednym badaniu wykazano, że HCdc14B jest głównie jąderkowy, jak ScCdc14 (ale w przeciwieństwie do CeCdc14), ale inne wykryły hCdc14B na włóknach jądrowych i wrzecionie
Podczas gdy wyczerpanie RNAi w hCdc14A i hCdc14B doprowadziło do defektów w duplikacji centrioli, progresji cyklu komórkowego i wyjściu mitozy, komórki usunięte dla genów nie wykazywały defektów wzrostu ani mitozy, a podobne niepowodzenie defektu cyklu komórkowego wykazano również w hodowanych ludziach komórki przy użyciu warunkowych nokautów hCdc14A i hCdc14B. Wreszcie, u kurcząt linie nokautowe całkowicie nie miały defektów w progresji cyklu komórkowego, wejściu lub wyjściu mitozy, cytokinezie lub zachowaniu centrosomu. Istnieją dowody na to, że Cdc14 może uczestniczyć w punkcie kontrolnym uszkodzeń DNA.
Nowatorską rolę Cdc14 u eukariontów zasugerowały badania Phytophthora infestans , eukariotycznego drobnoustroju znanego najlepiej jako przyczyna Wielkiego Głodu w Irlandii . Warto zauważyć, że chociaż wszystkie wymienione powyżej gatunki są stosunkowo bliskimi krewnymi taksonomicznymi (w grupie Fungi / Metazoa), P. infestans ma odrębną historię ewolucyjną; jest klasyfikowany jako lęgniowiec i jest członkiem Królestwa Stramenopila ( Heterokontów ) wraz z okrzemkami i brunatnicami. Pojedynczy gen Cdc14 P. infestans (PiCdc14) ulega ekspresji inaczej niż u grzybów i metazoanów; zamiast być transkrybowany przez cały cykl komórkowy i regulowany posttranslacyjnie, PiCdc14 znajduje się pod silną kontrolą transkrypcji i nie ulega ekspresji w strzępkach, gdzie zachodzi większość mitozy. Zamiast tego PiCdc14 powstaje podczas tworzenia bezpłciowych zarodników, w tym biflagelowanych zoospor . Stwierdzono, że PiCdc14 gromadzi się w pobliżu ciał podstawowych, u podstawy wici. W świetle różnych ról Cdc14 u grzybów i zwierząt zasugerowano, że dane P. infestans sugerowały, że przodkowa rola Cdc14 obejmowała stadium wici eukariontów. Dodatkowe dane na poparcie tej teorii uzyskano później z badań danio pręgowanego, gdzie stwierdzono, że jego białka Cdc14 również lokalizują się w ciele podstawowym i odgrywają rolę w tworzeniu rzęsek, które są krótkimi formami wici.
Cdc14 bierze również udział w regulacji kluczowych etapów mejozy w pączkujących drożdżach. Cdc55, podjednostka regulatorowa fosfatazy białkowej 2 (PP2A), sekwestruje Cdc14 w jąderku we wczesnym stadium mejozy. Sekwestracja Cdc14 jest niezbędna do złożenia wrzeciona mejozy I. Chociaż sekwestracja Cdc14 na wczesnym etapie nie jest niezbędna do rozdzielenia chromosomów. Białka złożone FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release), SLK19 i SPO12 regulują uwalnianie Cdc14. Uwolnienie Cdc14 z jąderka powoduje inaktywację cdk1 i ostatecznie demontaż wrzeciona podczas anafazy mejozy I. Komórki pozbawione Cdc14 lub SLK19 i SPO12 mają nieprawidłową mejozę. Mają tylko jeden podział podczas mejozy. Chromosomy również nieprawidłowo segregują. Nieprawidłowość wynika z opóźnienia w rozkładaniu wrzeciona podczas anafazy I. Jednak segregacja chromosomów trwa nadal i obie fazy segregacji mejotycznej zachodzą na przedłużonym wrzecionie mejozy I. Cdc14 wraz z SPO12 i SLK19 odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu, że dwie fazy segregacji chromosomów zachodzą kolejno podczas mejozy.
Dystrybucja Cdc14 poprzez ewolucję
Cdc14 jest szeroko rozpowszechniony i występuje w większości królestw eukariotów. Jednak nie występuje u wszystkich gatunków na podstawie przeszukiwania zsekwencjonowanych genomów. Jeden lub więcej genów Cdc14 znajduje się w pęcherzykach płucnych, zwierzętach, grzybach, trypanosomach i roślinach niższych. Jednak geny Cdc14 najwyraźniej zostały utracone w niektórych liniach, w tym w roślinach wyższych, różeńcach i śluzowcach. Istnieje dość ścisła pozytywna korelacja między obecnością Cdc14 u gatunku a tym, czy ten gatunek wytwarza wici czy rzęski . Może to być związane z rolą przodków Cdc14. Dyskutowano, czy ciała podstawowe zakotwiczone w wici lub centriole zaangażowane w mitozę pojawiły się jako pierwsze podczas ewolucji, ale jedna z teorii głosi, że wici wyewoluowały najpierw jako organelle ruchowe i czuciowe, a ciało podstawowe zostało później dokooptowane do roli mitotycznej. Funkcja Cdc14 mogła przystosować się do różnych funkcji podczas ewolucji tych organelli.
Cele
Większość informacji na temat biochemicznej funkcji Cdc14 pochodzi z badań S. cerevisiae. U tego gatunku jednym z ważnych celów jest Cdh1/Hct1. Cdh1 wiąże się z APC i prowadzi do aktywności APC (kompleks promujący anafazę); aktywowany APC jest kluczowym czynnikiem w wyjściu mitotycznym. Ponadto Cdc14 defosforyluje stechiometryczny inhibitor cyklin mitotycznych, Sic1 , stabilizując białko Sic1. Aktywność Cdc14 prowadzi również do stabilizacji czynnika transkrypcyjnego Swi5, co prowadzi do regulacji w górę transkrypcji Sic1. Możliwe, że Cdc14 działa jako fosfataza na wszystkie cele Clb-Cdk1, działając w celu odwrócenia działania cyklin mitotycznych.
Cele Cdc14 są najwyraźniej dość zróżnicowane. Metody wychwytywania dwóch hybryd i powinowactwa drożdży zidentyfikowały wiele białek, które potencjalnie oddziałują z ScCdc14, w tym te, o których wiadomo, że regulują cykl komórkowy i replikację DNA lub które łączą się z wrzecionem lub kinetochorem. Wydaje się również, że Cdc14 hamuje polimerazę RNA I, co pomaga w całkowitym rozłączeniu chromosomów poprzez eliminację transkryptów rybosomalnego RNA (rRNA), które w przeciwnym razie blokowałyby wiązanie kondensatu z rDNA.
Rozporządzenie
U S. cerevisiae Cdc14 jest regulowany przez konkurencyjny inhibitor Cfi/Net1, który lokalizuje Cdc14 w jąderku. Podczas anafazy Cdc14 jest „odblokowany” i rozprzestrzenia się na resztę komórki. Dwie sieci pośredniczą w uwalnianiu Cdc14 z jąderka: FEAR (CDC Fourteen Early Anaphase Release) i MEN (Mitotic Exit Network); chociaż te sieci są złożone, uważa się, że te sieci powodują fosforylację Cfi/Net1 i/lub Cdc14, co skutkuje dysocjacją kompleksu. Wiadomo, że u S. pombe fosforylacja ortologu Cdc14 przez Cdk1 bezpośrednio hamuje aktywność katalityczną fosfatazy.