ClickSeq

ClickSeq to metoda oparta na chemii kliknięć , służąca do generowania bibliotek sekwencjonowania nowej generacji dla platform głębokiego sekwencjonowania, w tym Illumina , HiSeq, MiSeq i NextSeq. Jego funkcja jest podobna do większości innych technik generowania RNAseq lub DNAseq , ponieważ ma na celu generowanie losowych fragmentów próbek biologicznych RNA lub DNA i dołączanie określonych adapterów sekwencjonowania do obu końców każdego fragmentu, zgodnie z wymaganiami konkretnej platformy sekwencjonowania do użycia (np. HiSeq).

W ClickSeq reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) są uzupełniane małymi ilościami 3'- azydo -nukleotydów (AzNTP) w określonych proporcjach do dezoksyrybonukleotydów (dNTP). AzNTP są terminatorami łańcucha i dlatego indukują stochastyczne zakończenie syntezy cDNA przy średniej długości określonej przez stosunek AzNTP do dNTP. Powoduje to wytwarzanie jednoniciowych fragmentów cDNA, które zawierają grupę azydową na swoich końcach 3'. Te 3'-azydo-blokowane cząsteczki cDNA są oczyszczane z dala od składników reakcji RT, a następnie „ligowane przez kliknięcie” do adapterów DNA modyfikowanych 5' alkinami poprzez katalizowaną miedzią cykloaddycję azydkowo-alkinową (CuAAC). To generuje cząsteczki ssDNA z nienaturalnymi szkieletami DNA połączonymi triazolami . Niemniej jednak te matryce są używane w reakcjach PCR i amplifikowane w celu wygenerowania biblioteki sekwencjonowania cDNA z odpowiednimi adapterami sekwencjonowania 5' i 3' oraz wskaźnikami wymaganymi do sekwencjonowania nowej generacji. ClickSeq był głównie używany do sekwencjonowania wirusowych genomów RNA, takich jak wirus Flock House , wirus paraliżu krykieta i wirus Zika , ze względu na jego odporność na tworzenie sztucznych chimer.

Poli(A)-ClickSeq

Poly(A)-ClickSeq to wariant ClickSeq przeznaczony do celowania w połączenie trzech głównych nieulegających translacji regionów (UTR) i poli(A)-ogonów informacyjnych RNA (mRNA) organizmów wyższego rzędu i wirusów RNA infekujących te rodzaje komórek. Podstawowa zasada jest podobna do ClickSeq, jednak etap odwrotnej transkrypcji wykorzystuje starter oligo-dT (niezakotwiczony) do zainicjowania syntezy cDNA z ogona poli (A) i tylko trzech 3'azydo-nukleotydów (AzATP, AzGTP i AzCTP , łącznie określane jako AzVTP) są uzupełniane. Ze względu na pominięcie AzTTP, podczas odwrotnej transkrypcji ogona poli(A) nie może wystąpić stochastyczne zakończenie syntezy cDNA. Terminacja może raczej wystąpić tylko w 3'UTR w odległości powyżej ogona poli (A), określonej przez stosunek AzVTP do dNTP.

Aplikacje

ClickSeq i Poly(A)-ClickSeq zapewniają określone zastosowania w porównaniu z innymi popularnymi technikami RNA-seq. Obejmują one:

1. Usunięcie etapów fragmentacji RNA: gdy etap odwrotnej transkrypcji jest losowo primowany, a synteza cDNA jest zakończona przez 3'-azydonukleotydy, fragmenty cDNA mogą być generowane bez chemicznej, mechanicznej lub enzymatycznej fragmentacji próbki RNA
2. Usunięcie enzymów ligazy RNA/DNA: W ClickSeq nie ma etapów ligacji RNA lub DNA, które są powszechnie wymagane w większości strategii syntezy bibliotek sekwencjonowania nowej generacji
3. Redukcja artefaktycznej rekombinacji: W oryginalnej publikacji ClickSeq, Routh et al. wykazali, że sztuczne generowanie chimer cDNA zostało znacznie zmniejszone przy użyciu ClickSeq. Pozwoliło to autorom wykryć rzadkie rekombinacji RNA , które pojawiają się podczas replikacji wirusa Flock House .
4. Poly(A)-ClickSeq nie wymaga wzbogacania ani oczyszczania mRNA lub wirusowych RNA z próbek biologicznych. Zamiast tego Poly(A)-ClickSeq można przeprowadzić w prosty sposób bezpośrednio z surowego RNA lub całkowitego komórkowego RNA wyekstrahowanego z próbek biologicznych.
5. Katalizator miedziowy wymagany dla CuAAC może indukować uszkodzenia oksydacyjne matrycy DNA